神经血管单元参与高血糖加重缺血性脑损伤及与解偶联蛋白-2关系研究

In order to know whether neurovascular unit（NVU） were involved in hyperglycemia aggravated ischemic brain injury and the relationship with UCP2. UCP2 knock out mice and genetic background C57BL/6j mice will be used to make hyperglycemia and non hyperglycemia model with brain ischemia.Neuron and glial cells will be labeld. Micro vascular endothelial cell line and primary cultured cerebral cortex micro vascular endothelial cell will be treated with high lactic acid and / or high glucose with oxygen deprivation. Light microscope and electron microscope observation will be used to observe the cerebral ischemic injury and microvascular endothelial cell morphology; ROS content will determined by DHE method; mitochondrial respiratory oxygen will determined electrode; mitochondrial membrane potential will determined by JC-1; occluding, VE-cadherin and MMP-9 will be determined by immunohistochemistry and western to show endothelial cell function. And mitochondria fusion / fission relating proteins(（Drp1，Mfn1/2，OPA1）and vascular endothelial cell activation and regeneration proteins (e-NOS, n-NOS, PKC, PCNA,VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2, ZO-1, MMP-9) will be detected also. The results will provide new ideas for the prevention and treatment of ischemic brain injury.

为明确神经血管单元(NVU)是否参与高血糖加重缺血性脑损伤及与UCP2关系，本研究拟利用低表达UCP2基因敲除型和C57BL/6j两种小鼠模型制备高血糖和非高血糖大脑中动脉缺血模型，特异标记神经元和胶质细胞，内皮细胞系和原代培养脑皮层微小血管内皮进行高乳酸和/或高糖条件下进行氧剥夺实验，光镜和电镜观察脑缺血损伤及与微小血管，内皮细胞形态；DHE法测定ROS含量；氧电极测定线粒体呼吸；JC-1测定线粒体膜电位；免疫组织化学等测定occludin，VE-cadherin 和 MMP-9检测神经血管单位功能状态，以及检测线粒体通路相关基因和凋亡相关基因，线粒体融合/分裂相关基因（Drp1，Mfn1/2，OPA1）；血管内皮细胞活化和再生相关基因（PCNA，e-NOS，n-NOS，PKC， VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2，ZO-1, MMP-9)，结果将给防治高血糖加重脑损伤提供新思路。

高血糖加重脑缺血再灌注损伤的机制尚不清楚，为明确神经血管单元(NVU)是否参与高血糖加重缺血性脑损伤及与解偶联蛋白 2（UCP2）关系，本研究通过体内外模型，研究了高血糖加重NVU、微血管损伤及其相关分子机制，并通过枸杞多糖和氧化苦参碱预处理，探讨了高血糖脑缺血再灌注损伤的干预方法及其相关机制。结果显示，高血糖加重脑组织损伤；Occludin的恢复比正常血糖时更差；血管周星形胶质细胞终足的丢失加重，加剧AQP4表达的上调和极性分布的丢失，星形胶质细胞活化的幅度降低，活化时限延长；增加脑缺血再灌注后促炎因子的上调，加重中性粒细胞的浸润，抑制小胶质细胞的活化和增殖。与UCP2野生型小鼠比较，UCP2缺失小鼠高血糖时脑组织损伤更重，其血清中IL-1β和IL-18的释放量明显高，在高血糖时NLRP3表达明显增加。高糖缺氧再复氧时，进一步增加炎症、凋亡相关因子表达水平。高血糖能够导致NVU的整体结构紊乱，紧密链接蛋白、磷酸化GSK-3β降低，在缺血前使用枸杞多糖能够保护NVU、缓解损伤，维持紧密链接蛋白和磷酸化-GSK-3β的表达。高血糖时梗死周围血管密度显著降低，微血管壁结构改变；血管分离指数显著增加，微血管结构改变；微血管减少；而在缺血前给予氧化苦参碱，上述指标明显好转。人脑微血管内皮细胞（HBMECs）实验可见，高糖时细胞活力进一步降低，细胞迁移减少；氧化苦参碱能够维持细胞活力、迁移能力和血管形成能力。结果提示，高血糖通过损伤NVU结构、功能，炎症反应、氧化应激、蛋白表达等途径，加重脑缺血再灌注损伤；高血糖加重脑缺血再灌注NVU损伤涉及微血管再生抑制、微血管水通道蛋白表达下调、wnt信号通路抑制；枸杞多糖通过激活Wnt/β-catenin信号通路保护NVU缓解高血糖加重的脑缺血再灌注损伤；氧苦参碱能够减轻高血糖脑缺血再灌注损伤，涉及微血管保护和再生。