Bcl-2家族蛋白共价抑制剂——基于结构的分子设计和共价修饰“弹头”的筛选

Bcl-2 family proteins are tumor target proteins. Anti-apoptotic Bcl-2 and Mcl-1 regulate cellular apoptosis via protein-protein interactions (PPIs) with pro-apoptotic proteins. A targeted covalent inhibitor (TCI) is designed such that the initial, reversible association is followed by the formation of a covalent bond between an electrophile on the ligand and a nucleophilic center in the protein. Herein, we planned to incorporate electrophile “warheads” into S1, a noncovalently Bcl-2 family inhibitor, which would allow site-specific covalent modification of Bcl-2 family proteins’ nucleophilic residues and provide potential covalent Bcl-2 family inhibitors as drug leads for targeted cancer therapy. Covalent inhibition was utilized to overcome the increased affinity of the PPI inhibitors. Moreover, a variety of novel electrophilic “warheads” will be discovered for covalent inhibitors design. Finally, we also will discuss the importance of the rate of covalent modification, in interpreting structure-activity relationships (SARs), translating activity from biochemical assays to the cell and more accurately defining selectivity.

Bcl-2家族蛋白是肿瘤靶标蛋白。Bcl-2和Mcl-1蛋白通过与促凋亡蛋白的蛋白-蛋白相互作用（PPI）调控细胞凋亡。申请人拟在自主研发的Bcl-2蛋白非共价抑制剂的分子骨架上连接亲电基团，共价结合Bcl-2蛋白和/或Mcl-1蛋白上的亲核氨基酸残基，首次获得特异性Bcl-2蛋白共价抑制剂、特异性Mcl-1蛋白共价抑制剂和Bcl-2/Mcl-1共价双抑制剂分子。通过与靶蛋白上的氨基酸残基发生不可逆结合，显著增强小分子的亲和力，突破PPI靶标抑制剂亲和力普遍偏低这一瓶颈，获得更高抗肿瘤活性的候选药物。本研究还将筛选和评价具有多样性的共价修饰“弹头”，丰富亲电基团的种类和共价修饰氨基酸残基的反应类型。通过分析结合动力学参数与共价抑制剂分子的特异性、亲和力和脱靶毒性的关系，为Bcl-2家族PPI共价抑制剂以及其它PPI靶标共价抑制剂提供“弹头”的分子设计原则。

本项目提出自主研发的Bcl-2蛋白非共价抑制剂的分子骨架上取代各种亲电基团或光亲和基团，共价结合Bcl-2蛋白和/或Mcl-1蛋白上的亲核氨基酸残基，获得特异性Bcl-2蛋白共价抑制剂、特异性Mcl-1蛋白共价抑制剂、和Bcl-2/Mcl-1共价双抑制剂分子。通过与靶蛋白上的氨基酸残基发生不可逆结合，显著增强小分子的亲和力，突破蛋PPI靶标抑制剂亲和力普遍偏低这一瓶颈，获得更高抗肿瘤活性的候选药物。同时还将利用共价分子与靶标的不可逆结合作用，将其偶联报告基团合成基于活性的分子探针，利用基于活性的蛋白质组学手段在活细胞内进行“靶点垂钓”，获得能与已知Bcl-2抑制剂结合、具有Bcl-2家族特征结构BH3沟槽的未知Bcl-2家族蛋白。最后，筛选和评价具有多样性的共价修饰“靶头”，丰富亲电基团的种类和共价修饰氨基酸残基的反应类型。通过分析结合动力学参数kobs、kina、KI、和kina/KI与共价抑制剂分子的特异性、亲和力、和脱靶毒性的关系，为Bcl-2家族PPI共价抑制剂以及其它PPI靶标共价抑制剂提供“靶头”的分子设计原则。在项目实施过程中，我们首先共价修饰的亲电性“靶头”的设计合成、“靶头”与非共价抑制剂分子骨架的链接、Bcl-2/Mcl-1共价抑制剂的体外筛选、在细胞和小鼠模型内对于Bcl-2/Mcl-1共价抑制剂的活性评价等方面均取得了重要进展，获得了一系列在细胞内筛选低脱靶毒性的、依赖Bcl-2通路抗肿瘤的Bcl-2家族蛋白共价抑制剂药物先导；进一步，通过连接与磷酸化位点附近作为“构象开关”的精氨酸特异性反应的“靶头”，获得特异性诱导Bcl-2去磷酸化的分子探针，实现对Bcl-2蛋白磷酸化修饰的原位化学干预。另一方面，我们以共价Bcl-2抑制剂为识别基团，设计合成了一系列基于活性的分子探针的并通过“靶点垂钓”的方法发现了一个全新的Bcl-2家族新抗凋亡成员——热休克蛋白70（Hsp70）；最后，对药物候选分子S1系列衍生物的取代基进行生物电子等排体替换，使得其具有与蛋白表面的赖氨酸发生亲核取代反应并发生荧光“turn-on”的性质，获得集荧光性质和抗癌活性为一体的“二合一“turn-on”荧光分子探针。