炎症微环境下M2Mφ来源TGF-β1调控腱病发生的机制研究

Recent epidemiological evidences demonstrate that the prevalence of tendinopathy is increasing and the cure rate is low, highlighting the emergent needs to investigate its pathogenesis. Tissue fibrosis is one of its main characteristics of it. Transforming growth factor β-1 (TGF-β1) is highly expressed in tissues from a variety of tendon diseases and activates fibroblasts, leading to aberrant fibrosis. However, cellular origins of TGF-β1 in tendinopathy have yet been fully elucidated. The latest publications have shown that Inflammatory microenvironment play an important role in the body damage. Existing research shows that tendinopathy in the inflammatory response in macrophages (Mφ) invasion. Our preliminary experiments the tendinopathy tissues are characteristic of typical inflammation, with infiltration of type M2 macrophages (M2Mφ) and high expression of TGF-β1. Therefore, we propose that infiltrating M2Mφ in these tissues could build locally inflammatory microenvironment by secreting TGF-β1, which may exert its functions in a paracrine manner to engage the TGF-β receptor complexes (TGF-βRI/II) in fibroblasts and activate the downstream signaling pathways. In such a manner, M2Mφ might play a crucial role in activating fibroblasts, thus contributing to the pathogenesis of tendinopathy. This topic to study whether (1) the M2Mφ is the important source cells for release TGF - beta 1; (2) TGF - beta 1 through the TGF - beta receptor mediated mechanism of tendon tissue fibrosis. It is expected to reveale a new mechanism for the pathogenesis of tendinopathy, and new train of clinic thought and targets for prevention and cure of the disease.

腱病是最常见软组织退行性病变，机制尚未阐明并缺乏有效治疗手段。组织纤维化是其最主要的特征之一。转化生长因子-β1是纤维化关键因子，在多种腱病中高表达，但来源和作用机制尚不清楚。最新研究及我们的预实验均显示腱病中炎症反应持续存在，以M2亚型巨噬细胞侵润为主，同时伴TGF-β1高表达。据此推测炎症微环境下，腱病组织中M2Mφ来源的TGF-β1，通过激活组织内TGF-β受体及其下游通路，介导组织纤维化，可能是腱病发生重要机制。本课题拟通过临床病理学观察人腱病组织中Mφ、TGF-β1和纤维化关系；以M2Mφ选择性TGF-β1基因敲除小鼠和野生型小鼠建立腱病模型并给予TGF-βR治疗干预；以TGF-β1基因敲除M2Mφ与成纤维细胞共培养给予重组TGF-β1,TGF-β1抗体干扰等，从人体组织，动物，细胞模型三个层面全面研究M2Mφ来源TGF-β1在肌腱组织纤维化中的分子机制。有望揭示腱病发生新机制。

研究目的：研究腱病组织中TGF-β1是否主要来源于M2巨噬细胞，以及TGF-β1通过激活组织内TGF-β受体及其下游通路，介导组织纤维化，可能是腱病发生重要机制。.研究内容：通过组织学及Western Blot检测来明确成人腱病组织中是否存在巨噬细胞及其主要亚型、TGF-β1及其促纤维化通路下游关键因子的表达，并与正常肌腱组织进行比较。采用针刺+跑台方法建立腱病动物模型。培育巨噬细胞特异性TGFβ1基因敲除小鼠并建模成功后，通过HE染色，免疫组化，生物力学，分子生物学检测来验证M2巨噬细胞是否是TGF-β1生成的重要来源。对建模成功实验动物注射TGFβ封闭抗体，通过组织病理学染色，生物力学检测探讨巨噬细胞与纤维化关键因子TGF-β1之间的关系。诱导巨噬细胞极化为M1和M2型，分别检测TGF-β1的生成情况。体外培养肌腱细胞，添加外源性TGF-β1进行TGF-β1通路激活实验，验证 TGF-β1在肌腱组织纤维化病理改变中的关键作用；M2型巨噬细胞与肌腱细胞体外共培养，并用TGF-β1通路抑制剂和TGF-β1中和抗体进行干预，研究M2型巨噬细胞分泌的TGF-β1在肌腱组织纤维化中的机制。.研究结果：人体组织学观察可见TGF-β1阳性区域与M2型巨噬细胞存在的区域基本吻合，腱病组M2型巨噬细胞数量与TGF-β1的表达量呈高度相关性。腱病组标本中有大量TGF-β1表达，通过免疫荧光共定位观察，发现TGF-β1高表达区域与M2型巨噬细胞所在位置重叠度高。动物实验中基因敲除实验结果显示M2型巨噬细胞及TGF-β1表达。结果有明显的统计学差异，P<0.001。细胞学实验结果表明肌腱病中存在慢性炎症反应，其组织中含有较多巨噬细胞且以M2型巨噬细胞为主，且纤维化基因表达增强。.结论：M2型巨噬细胞是肌腱组织炎症微环境下TGF-β1生成的重要来源，TGF-β1可以通过TGF-β1/Smad信号通路介导肌腱纤维化，是可能导致肌腱病的重要机制。但还无法证明M2型巨噬细胞源性TGFβ1在肌腱病发病机制中起唯一或最主要作用。