自组装多肽水凝胶联合转基因嗅鞘细胞促进损伤脊髓再生的研究

脊髓损伤（SCI）发病率居高不下，是临床亟待解决的难题。目前利用组织工程技术修复脊髓损伤成为研究的热点，其核心是构建理想的支架材料。自组装多肽纳米纤维水凝胶因具有良好的材料-细胞界面相容性和生物活性而成为支架材料发展的一个非常重要的方向。本课题设计综合应用多肽自组装与基因工程技术，选择细胞外基质（ECM）、神经细胞粘附分子（NCAM）中的核心多肽片断RGD和FGL，两者共同自组装成为具有良好生物活性的多肽纳米纤维水凝胶，联合转染的神经营养素-3(NT-3）协同作用于嗅鞘细胞（OEC），促进嗅鞘细胞生长、黏附及其生物学功能。RGD/FGL双多肽自组装纳米纤维水凝胶及转基因OEC移植后明显促进损伤脊髓的修复。此设计在国内外尚未见报道，为脊髓损伤修复开辟了新的途径。

[摘 要] 目的: 观察一种新的多肽水凝胶支架材料GRGDSPmx（由多肽RADA16和RGD溶液混合而成）与转基因嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell, OECs)的生物相容性。方法: 采用原代分离培养方法获得OECs单细胞悬液后，用差速贴壁法纯化OECs，用NGFRp75、Hoechst33342等抗体行免疫荧光染色鉴定OECs并进行纯度测定，应用脂质体介导的方法将构建的质粒pEGFP-NT3导入OECs，通过Emax immunoassay system检测转染后NT-3分泌量，MTT法检测转染后OECs的增殖。分别将转染后的OECs种植于多肽RADA16和GRGDSPmx支架凝胶内部(三维培养)，光镜和扫描电镜观察OECs在多肽材料中的形态变化特点，并采用NGFRp75阳性细胞计数，Calcein-AM活细胞染色统计分析检测支架对细胞的毒性来评价细胞的活力。 结果：使用差速贴壁法纯化OECs且在第5天通过免疫荧光染色计数OECs纯度为85%。转染后的OECs可以分泌出NT-3，其增殖能力与未转染组无显著性差异（P＞0.05），接种到多肽RADA16和GRGDSPmx水凝胶后，光镜和扫描电镜观察发现，大多数OECs能在多肽水凝胶支架材料中生长良好，免疫荧光染色研究表明，GRGDSPmx实验组中OECs存活数目明显高于RADA16对照组（P<0.05）。结论：GRGDSPmx能自组装形成纳米纤维水凝胶，与大鼠转基因OECs有良好的生物相容性和生物活性。