GLP-1对阿尔茨海默病生物节律紊乱的调节研究

Based on the similarity in the pathogenesis of Type Ⅱ diabetes (T2DM) and Alzheimer disease (AD), our previous studies have proved that T2DM therapeutic drug glucagon-like peptide-1 (GLP-1) played a neuroprotective role through improving learning and memory function, and revealed part of the mechanism. Combined with the phenomenon that early AD patients appear biorhythm disorder，we assume that GLP-1 play a neuroprotective role in regulating the biorhythm disorder of AD. The study will observe the change of biorhythm in the process of GLP-1' neuroprotection through the mice' running wheel behavioral test in 12:12 LD (12 h-light : 12 h-dark cycle) and DD (constant darkness), investigate the expression of cAMP and CREB, observe the growth and apoptosis of neurons in the process of rhythmic regulation using cultured cells. Furthermore, we will clarify the change of circadian clock genes using real-time quantitative PCR and the importance of GLP-1 in regulating the biorhythms at the level of in vitro and in vivo using RNA interference and gene over-expression technology. The study will provide experimental evidence for GLP-1 involved in the regulation of biorhythm disorder of AD and possible mechanism in the process of neuroprotection. Simultaneously，the study will provide more reasonable strategy for the prevention and treatment of AD.

基于阿尔茨海默病（AD）与Ⅱ型糖尿病（T2DM）在发病上的相似性，我们的前期研究证明T2DM治疗性药物胰高血糖素样肽1（GLP-1）能够改善AD大鼠的学习记忆，并揭示了部分神经保护作用机理。结合AD患者早期出现的生物节律紊乱现象，我们设想GLP-1通过调节AD生物节律紊乱来发挥神经保护作用。本研究将采用动物跑轮行为学测试，观察在GLP-1作用下，小鼠在12：12LD（12小时开灯，12小时灭灯，光暗循环）和DD（持续黑暗）环境下生物节律的改变情况；通过离体细胞培养探讨节律性调控过程中cAMP和CREB的表达，观察神经细胞生长和凋亡情况，进一步采用实时定量PCR技术阐明生物钟基因节律变化，应用RNA干扰技术和基因过表达技术在细胞水平和在体水平研究GLP-1在生物节律调控过程中的重要性，从而为GLP-1参与调节AD生物节律紊乱和可能机制提供实验证据，为预防和治疗AD提供更合理的策略。

阿尔茨海默病（AD）早期即可出现明显的昼夜节律紊乱，昼夜节律紊乱又会加重学习记忆能力下降，改善AD昼夜节律紊乱至关重要。结合2型糖尿病与AD发病的相关性，本项目开展2型糖尿病治疗性药物胰高血糖素样肽1（GLP-1）改善Aβ所致昼夜节律紊乱的作用及机制，继而改善学习记忆能力下降的研究，并初步探讨AD昼夜节律紊乱和自噬的关系。首先经C57BL/6小鼠海马内注射Aβ，建立AD模型；采用动物跑轮行为学和Morris水迷宫实验证实Aβ诱导小鼠出现昼夜节律紊乱和学习记忆能力下降；继而证实GLP-1类似物Exendin-4鼻腔和海马内给药均可改善Aβ所致昼夜节律紊乱和学习记忆能力下降且作用相当；Liraglutide，Oxy和DA-JC1等多种GLP-1类似物也显著改善了Aβ诱导的小鼠昼夜节律紊乱和学习记忆能力下降。机制研究发现，cAMP/CREB参与GLP-1改善Aβ诱导的昼夜节律紊乱，且CREB参与Liraglutidec改善Aβ诱导的节律基因/蛋白Per1异常表达的过程；另外，生物钟基因参与GLP-1调整AD昼夜节律紊乱，Exendin-4，Oxy和DA-JC1等改善了Aβ诱导的per1，per2，clock等基因表达异常；应用 RNA 干扰技术检测发现GLP-1R参与GLP-1改善Aβ所致HT22细胞Bmal1和Per2异常表达；且GLP-1可以改善Aβ诱导的小鼠海马神经元存活率的降低。进一步，在体GLP-1R基因沉默可以部分抑制GLP-1改善Aβ所致小鼠昼夜节律紊乱作用的发挥，且直接导致小鼠跑轮运动节律紊乱；per2基因沉默导致DA-JC1无法改善Aβ诱导的学习记忆障碍，per2-/-诱导昼夜节律紊乱，学习记忆能力下降和SYP和GAP-43表达降低，DA-JC1无法改善Aβ所致的SYP、GAP-43蛋白表达降低。基于AD时Aβ累积且不易清除的事实，我们增加了自噬参与Aβ诱导的昼夜节律紊乱的研究内容，结果发现Aβ诱导HT22细胞自噬功能障碍，自噬流受阻且Aβ介导的溶酶体功能障碍可能为参与机制；另一方面，自噬功能障碍参与Aβ诱导的昼夜节律紊乱，Rapa可以部分恢复Aβ所致HT22细胞自噬功能障碍，缓解Aβ所致C57BL/6小鼠昼夜节律紊乱和Per2，Bmal1异常表达。我们希望通过本研究帮助寻找调节昼夜节律相关的新的有效靶点，为AD早期治疗及预防提供必要的理论基础。