应用De-TILLING筛选技术研究重离子束辐照对百脉根结瘤基因的诱变效应

Lotus japonicas as a model species of legume plants have received increasing attention in the field of symbiotic nitrogen fixation. Rhizobia could generate symbiont-nodules specifically after invasion of legume plant tissues. This symbiotic relationship is involved in signal transduction, gene expression and molecular interactions between microorganism and host plants. Nodule inception gene (NIN), receptor-kinases genes including nod factor receptor 1 and 5 (NFR1, NFR5) of Lotus japonicas jointly participate the reception of nodulation signal. In this application project, dry seeds of Lotus japonicas irradiated by heavy ions accelerated by HIFRL-CSR will be screened by Deletion-TILLING technique which has been applied successfully in plant mutants reverse screening operations in recent years, aiming at detecting specific target genes (NIN, NFR1 and NFR5) in the obtained M2 generation through large-scale and high-throughput analysis. Samples irradiated by X-rays will be analyzed as reference to compare the mutation efficiency between heavy ions and X-rays. The spectrum of mutation will also be drawn. Meanwhile, gene-sequencing technique will be used to detect supernodulation or nonnodulation mutants in order to compare variable sites of gene with phenotypes so that data will be collected and accumulated for gene-function research of nodulation genes in the future.

百脉根作为研究共生固氮体系的豆科模式植物之一，在生物固氮研究领域日益受到重视。根瘤菌与豆科植物能特异的形成共生体-根瘤，这种共生关系涉及到微生物与宿主植物的信号传递、基因表达及分子相互作用。百脉根的起始结瘤基因NIN、结瘤因子受体激酶基因NFR1和NFR5等共同参与接受结瘤信号。本申请项目利用HIFRL-CSR提供的重离子束辐射诱变豆科模式植物百脉根干种子，采用近年来在突变体反向遗传学筛选中成功应用的"删除-定向诱导基因组局部突变技术"（Deletion-TILLING），选取结瘤相关基因NIN、NFR1和NFR5等为靶基因，高通量分析M2 代突变材料，比较重离子与X射线辐照的突变效率及突变谱，力争获取超量结瘤或不结瘤的突变材料，将基因的变异位点与表型进行比较,并采用基因测序技术分析突变材料，为下一步进行结瘤基因的基因功能分析奠定基础。

将重离子诱变技术应用于豆科模式植物百脉根的育种研究中，采用反向遗传学高通量筛选方法，获得丰富的突变材料，这些突变材料将有助于进一步了解豆科作物结瘤相关基因的具体功能。百脉根具有自花授粉、种子小、生长周期短、基因组小等特点，方便在实验室进行机理研究。日本Kazusa DNA 研究所于2008年完成了百脉根（MG-20生态型）全基因组序列分析（http://www.kazusa.or.jp/lotus/）。反向遗传学方法是基于“从基因序列分析到表型分析”，能够克服经典的正向遗传学“从突变表型到基因”的不确定性和盲目性。定向诱导基因组局部突变技术（Targeting induced local lesions in genomes, TILLING）作为反向遗传学方法的一种新技术，近年来在水稻、大麦、小麦等多种材料中得到了应用，经过改良的De-TILLING方法则可用于DNA大片段改变。John Innes Centre 的Rogers课题组使用De-TILLING高通量筛选技术进行了快中子诱变苜蓿研究。本项目组三年的研究成果如下：利用HIFRL-CSR提供的重离子束以及γ射线辐射诱变百脉根干种子，碳离子辐射（LET值37 keV/μm）半致死剂量（LD50）为400Gy，γ射线的半致死剂量为800Gy。获得碳离子和γ射线辐照百脉根干种子的各项形态学指标，包括种子萌发率，植株存活率、幼苗根长、株高和光合色素含量等。采用重离子规模化辐照1200粒百脉根干种子，从2472份M2代材料中经表型筛选获得了127份突变体，包括叶型、叶色、茎、花、分蘖数和根瘤等类型，这些突变材料为百脉根“表型-基因”关联研究提供了丰富的遗传材料。采用简单重复序列间（Inter simple sequence repeat，ISSR）技术分析分子多态性，从群体角度对突变体的基因变异进行表征。建立了适宜于分析百脉根突变体的De-TILLING筛选体系，完成了M2代材料的三维“塔式”DNA池，并且针对NIN, NFR1, NFR5, SYMRK, NSP1, CASTOR等靶基因设计引物，初步进行了De-TILLING筛选工作。遇到的问题：收获百脉根M2代及M3代种子所费周期过长，主要由于不同植株间开花时间不一致，制约了突变材料的遗传稳定性的检验。