基于TRP通道探讨当归四逆汤对奥沙利铂致周围神经毒性作用机制的研究

The most common adverse events of oxaliplatin is neurotoxicity, which limit it’s efficacy. In clinical, We found the Wenyangtongmai effect of Dangguisini soup has good effect on OXIN, the incidence of OXIN significantly reduced, the levi’s grade decreased. .The experiment before showed that Dangguisini soup can effectively delay the time and extent of pain threshold of the OXIN animal model, and the main target is the dorsal root ganglion. Further research showed that after acute isolated the DRG cells of OXIN rats successfully, added the TRPV1 agonist capsaicin, TRPV1 channel activated by using whole-cell patch-clamp technique.It prompt OXIN was closely related to the TRP channel activity.So we guess that depress the TRP channel activity maybe one of the most important mechanisms of OXIN therapeutic effect using Dangguisini soup..This project intends to use the technology of RT-PCR, Western blot, patch clamp and the establishment of OXIN rat model to explore the Dangguisini soup for the role of TRP channel through analysis electrophysiological changes and the effect of the protein expression.Through this study, we hope to provide the experimental basis for this classical prescription treatment of OXIN.

奥沙利铂（OXA）最常见的毒副反应为外周神经毒性（OXIN），限制了该药的充分应用。临床中我们发现具有温阳通脉作用的当归四逆汤对OXIN有较好的疗效，发生率明显减少，毒性分级（Levi’s评分）下降。.前期实验结果显示当归四逆汤可明显延缓OXIN动物模型疼痛阈值下降的时间和幅度，并发现其主要效应靶点为背根神经节（DRG）。进一步研究显示，在成功急性分离OXIN大鼠DRG细胞后，加入TRPV1激动剂辣椒素，采用全细胞膜片钳技术记录到TRPV1通道的激活，提示OXIN与TRP通道活性密切相关。由此我们推测，抑制TRP通道活性可能是当归四逆汤发挥防治OXIN效应的重要机制之一。.本项目拟采用RT-PCR、western blot、膜片钳及建立OXIN大鼠模型等技术，通过分析通道的电生理改变及对蛋白表达的影响，进一步探索当归四逆汤对于TRP通道的干预作用，为这一中医经方治疗OXIN提供实验依据

目的：在前期工作基础上，进一步研究当归四逆汤防治奥沙利铂神经毒性（OXIN）的作用机理。.方法：60只健康Wistar雄性成年大鼠，随机分为空白组、模型组、当归四逆汤低、中、高剂量组各12只。建立奥沙利铂神经毒性大鼠模型。1.检测大鼠的机械疼痛阈值。2.HE染色观察大鼠坐骨神经细胞，透射电镜观察大鼠双侧L5 DRG细胞，尼氏染色光镜测量大鼠DRG核仁。3.RT-PCR 和qPCR检测各组大鼠背根神经节TRPV1、TRPA1、TRPM8蛋白水平。4.急性分离各组大鼠DRG细胞，全膜片钳技术记录各组TRP通道电流。5.手动膜片钳记录当归四逆汤对大鼠DRG细胞TRP通道电流的影响。.结果：1.与空白组比较，模型组、当归四逆汤低、中剂量组出现明显的机械疼痛阈值下降（p＜0.05），而当归四逆汤高剂量组未出现明显的机械阈值下降（p＞0.05）。2.与模型组相比，当归四逆汤各组核仁体积缩小的程度较轻（p＜0.05）。3.与空白组比较，其余各组大鼠背根神经节TRPA1、TRPM8、TRPV1蛋白表达量明显增加（p＜0.01），与模型组比较，当归四逆汤高剂量组明显降低三者蛋白表达量（p＜0.01）。与空白组比较，其余各组大鼠背根神经节TRPV1、TRPA1、TRPM8 mRNA表达显著增加（p＜0.01），与模型组比较，当归四逆汤各组可显著下调三者表达（p＜0.01）。4.辣椒素可增加空白组以及模型组DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤各组对此的逆转作用不明显（p＞0.05）；薄荷醇、芥子油均可增加空白组及模型组的DRG细胞全细胞电流上升，当归四逆汤各组对此均有逆转作用（p＜0.05）。5.1μM奥沙利铂可诱导出明显的 TRPV1、TRPM8、TRPA1 电流，30μM当归四逆汤能抑制TRPM8、TRPA1 电流。.结论：当归四逆汤能延缓奥沙利铂诱导的机械疼痛阈值下降的幅度，改善OXIN大鼠DRG细胞线粒体肿胀和核仁大小的变化，通过下调OXIN大鼠背根神经节TRPA1、TRPV1、TRPM8表达水平和抑制奥沙利铂诱导的TRPM8 、TRPA1通道开放活性来有效防治OXIN。.科学意义：本研究从电生理角度证实当归四逆汤可抑制奥沙利铂诱导的TRPM8、TRPA1离子通道开放，首次揭示当归四逆汤改善TRPs通道活性作用的机制，具有一定科学创新意义与运用价值。