褪黑素调控绵羊卵泡颗粒细胞褪黑素受体表达的蛋白组学

The recent researchs show that melatonin has amplification effect on melatonin receptor expressing in the follicular granulosa cells. However, its mechanism of the action and the influence about oocyte maturation is not very clear. Whitin sheep ovarian follicles granulosa cells, by using cell isolation and culture, molecular biology, iTRAQ protein spectrum quantitative analysis, etc., the aims of this project are to research: (1)the time- and dose-dependent manners of melatonin promote MR mRNA expressing in granulosa cells; (2) differential proteomics of melatonin regulating the granulosa cells protein and granular cells exocrine protein;(3) the influences of differentially expressed exocrine protein factors on oocytes maturation in vitro.And then discusses related mechanisms of melatonin regulating granulosa cells of gene and protein expression. These will provide solid and scientific proof for revealing physiological role of melatonin in follicular development and for the further development and utilization of mammalian reproductive potential.

当前研究显示褪黑素对褪黑素受体在卵泡颗粒细胞中的表达有促进作用，而其作用机制及对卵母细胞成熟的影响机制还不清楚。本项目拟以绵羊卵泡颗粒细胞为研究对象，应用细胞分离和培养、分子生物学、iTRAQ蛋白质谱定量分析等实验方法，研究：①褪黑素促进绵羊卵泡颗粒细胞MR 表达的浓度和时间；②褪黑素调控绵羊卵泡颗粒细胞蛋白组学和细胞外分泌蛋白组学；③差异表达的外分泌蛋白因子对卵母细胞体外成熟的影响。进而探讨褪黑素调控颗粒细胞的基因和蛋白表达的关联机制，这将为揭示褪黑素在卵泡发育过程中的生理作用和为进一步开发和利用哺乳动物的繁殖潜能奠定基础。

本研究采集了成熟绵羊卵巢及不同生殖周期黄体组织，系统检测了褪黑素及其相关蛋白在绵羊发情黄体和妊娠黄体以及不同大小卵泡中卵丘复合体的水平及表达变化；建立绵羊卵母细胞和颗粒细胞的体外培养体系，并检测了雌二醇（E2）对卵母细胞和颗粒细胞褪黑素合成及其相关蛋白的影响和作用途径；通过Lablefree蛋白质组学方法检测了褪黑素对颗粒细胞的蛋白质表达影响并探寻相关作用途径。结果：发现在不同生殖周期的黄体和不同大小卵泡中的卵丘复合体中，褪黑素水平及其相关蛋白的表达存在显著差异，说明褪黑素对绵羊黄体以及卵巢卵泡和卵母细胞的发育和成熟起着重要的调节作用；E2抑制了卵丘复合体和颗粒细胞中褪黑素合成以及褪黑素受体的表达，并且E2的这种作用主要通过其受体ER途径完成；蛋白质组学结果显示，褪黑素引起颗粒细胞中64种蛋白发生显著变化，进一步生物学分析显示，褪黑素主要通过抗氧化损伤，细胞凋亡和细胞粘附等途径参与了对颗粒细胞的功能调节。