基于特异蛋白发现的胶类中药专属性鉴定研究

There are many counterfeits and adulterations of Gelatinous Chinese Medicines (GCMs), which are quite difficult to be identified by electrophoresis and DNA barcoding, etc. Moreover, methods based on mass spectrometry employ specific peptides fragments as authentication index, leading to a doubtful reliability. In our completed projects, it was concluded that signature proteins existing in GCMs have relatively stronger specificity for authentication purpose. On the basis of these, we propose that signature proteins in GCMs could be discovered by monoclonal antibodies, and furthermore accurate authentication of GCMs would be achieved. This study aims to resolve one of key scientific problems “GCMs are difficult to be accurately authenticated”, in which cutting edge phage-display technology will be employed to construct antibody library, with the incorporation of biopanning, bio-mass spectrometry, and eukaryotic cell recombinant expression, in order to obtain monoclonal antibodies for the discovery of signature proteins as novel authentication index for GCMs. Meanwhile, we are going to establish key authentication technology of high specificity by using Western Blot, and “Monoclonal Antibodies Information Database of Gelatinous Chinese Medicines” as well. These will provide a reliable strategy and method for authentication of GCMs and assist to ensure the safety and efficiency of GCMs consumed in clinical practice and their market order. In addition, this proposed project will construct a novel approach for the study of the specific authentication of GCM and lay a firm foundation for the authentication of preparation composed of GCMs, and it also has a broad prospect for development in the specific authentication of other animal-derived Chinese medicines.

胶类中药的伪品与掺伪品较多，电泳、DNA条形码等难以鉴别其真伪，而基于质谱技术的鉴定方法以特征性肽段为依据，可靠性存疑。已完成的基金项目研究表明，胶类中药含有的特异蛋白具有较强的专属性鉴定意义；在此基础上，我们提出：可以利用单克隆抗体发现特异蛋白，进而准确地鉴别胶类中药的真伪。本研究旨在解决“胶类中药难以准确鉴定”这一关键科学问题，拟选用较为先进的噬菌体展示技术构建抗体文库，并结合亲和淘选、生物质谱以及真核细胞重组表达等技术获取单克隆抗体，用于发现胶类中药的特异蛋白以作为新的鉴定依据；同时，采用Western Blot构建专属性强的关键检测技术，并建立单克隆抗体信息数据库，从而为鉴定胶类中药提供可靠的手段，有助于保障其临床用药的安全与有效以及维护市场秩序。本项目可为胶类中药的专属性鉴定研究开辟一条新的途径，并为鉴定含胶类中药的制剂奠定基础，在其它动物药的专属性鉴定方面也具有广阔的发展前景。

动物药应用历史悠久，是中药体系的重要组成部分之一，但是对其专属性鉴定的研究基础相对薄弱；因此，选择特异性高的目标分子和灵敏度高的分析技术，开展相应的基础研究并最终实现对动物药的准确鉴别显得十分急迫。胶类中药等动物药的需求量大、价格高，常见以低廉的伪品和掺伪品冒充真品销售进行非法牟利，如胶类中药以黄明胶、新阿胶和杂皮胶等冒充阿胶，目前其鉴定主要依据宏观或微观的外在可视特征、小分子或氨基酸等，存在一些固有的局限性，且依靠单一技术难以准确地鉴别其真伪，需要研究多种专属性鉴定技术。.本项目围绕胶类中药的专属性鉴定开展了研究工作，并取得了多方面的研究结果。本项目研究在具体执行过程中选择了鉴定难度较大的胶类中药为研究对象，包括阿胶、黄明胶、新阿胶、龟甲胶、鹿角胶、马皮胶等，以物种特异蛋白为鉴定依据，一方面以其中所含的特征性肽段为半抗原结合载体蛋白并进行动物免疫从而获得相应的抗体；另一方面通过胰蛋白酶等消化胶类中药蛋白质，经酶解产生的多肽片段以MALDI-TOF/TOF-MS分析和采用肽序列从头测序算法等蛋白质组学研究手段鉴定其特异蛋白，并结合特异性引物扩增鉴定阿胶、黄明胶的动物皮来源；此外，还对鹿角与鹿茸、水蛭、僵蚕等四味动物药的蛋白类化学成分进行分析，探索与解析这些动物药中的特异蛋白和多肽等，以作为它们的鉴定依据。此后，整合相关信息建立了“动物药鉴定数据管理系统”，为准确、可靠地检识动物药提供技术参数和数据支持，以便于所建立技术在动物药鉴定实践中的推广应用。本项目研究为胶类中药及动物药的专属性鉴定研究开辟一条新的途径，并促进医学免疫学、蛋白质组学、分子生物学与动物药鉴定的有机结合，具有重要的学术意义；此外，本项目可为保障其临床用药的安全与有效以及维护市场秩序，具有重大的应用价值，并且为鉴定含胶类中药的制剂奠定基础，在其它动物药和含蛋白质中药的专属性鉴定方面也具有广阔的发展前景。