不成熟DCs外泌体抗原特异性治疗实验性自身免疫性重症肌无力的实验研究

本研究拟采用miRNA干扰技术抑制imDC成熟，以获得稳定的imDC外泌体（imDex），并用exosome display技术负载免疫优势肽段，将Hα320-337-imDex注入重症肌无力小鼠（EAMG）体内，诱导抗原特异性免疫耐受。通过相关检测判定疗效并探讨治疗机制；同时用免疫磁珠技术分离重症肌无力病人外周血T、B淋巴细胞，将Hα320-337-imDex与之共同培养，检测相关免疫指标，证实Hα320-337-imDex对MG患者抗原特异性T、B细胞的抑制作用。由于合成肽段的获得较其它耐受原更为方便廉价；anti-miRNA干扰技术能从翻译水平有效抑制DC的分化成熟，但不改变mRNA的稳定性，可以安全、高效地获得imDC；应用其分泌的imDex治疗MG，具有制剂存储方便、可精确调控给药剂量、副作用轻微等特点，该方法的建立将为MG乃至其他自身免疫性疾病的抗原特异性治疗提供崭新的思路。

本研究发现小鼠不成熟DC经肽段Tα146-162刺激后表面MHCII，CD80，CD86表达增多，上清液中IL-6、IL-12水平升高；经microRNA-146a mimics转染的DC能抵抗Tα146-162的成熟刺激，转染组DC表面MHC II、CD80、CD86百分比和平均荧光强度均较未转染组降低，且转染组上清液中IL-6、IL-12水平较未转染组降低；经microRNA-146a mimics转染DC来源的外泌体表面CD80、CD86明显低于未转染microRNA-146a mimics的DC来源的外泌体。成功制备microRNA-146a mimics诱导的抗原特异性不成熟DC来源外泌体，它表面低表达CD80、CD86共刺激分子，这为进一步将microRNA诱导的不成熟DC来源外泌体用于自身免疫性疾病治疗奠定了基础。.进一步研究发现，该种外泌体在第五天能使AChR反应性CD4+ T细胞呈现低增殖反应，培养上清液中IL-17、IFN-γ水平显著降低，而 IL-4、IL-10水平显著增高。静脉注射不同剂量的Tα146-162-imDex均能降低EAMG小鼠的平均临床评分，及血清抗AChR IgG、IgG1、IgG2b水平。Tα146-162-imDex治疗组小鼠血清IL-4、IL-10水平较高，而IFN-γ和IL-17水平降低。Tα146-162-imDex治疗组脾淋巴细胞增值反应显著降低，Th17细胞标志物（IL-17，RORγt）和Th1细胞标志物（IFN-γ，T-bet）显著减低，Th2细胞标志物（IL-4，GATA3）、Treg细胞标志物 (FoxP3)水平显著增高。在无抗原及对照抗原ConA存在时，Tα146-162-mDex对照组脾脏CD4+ T细胞呈现低增殖反应；在T-AChR及Tα146-162存在时，AChR反应性CD4+ T细胞呈现高增殖反应；与Tα146-162-mDex治疗组脾脏淋巴细胞培养体系相比，Tα146-162-imDex治疗组中脾脏淋巴细胞培养体系中CD4+ T细胞增殖反应显著降低。这说明抗原特异性不成熟DC来源外泌体可以有效减轻EAMG的肌无力程度及病理性自身抗体水平，其治疗效果是呈抗原特异性和部分剂量依赖性的，其机制与外泌体减轻CD4+T淋巴细胞增殖反应、调整Th细胞由Th17、Th1向Th2、Treg极化有关。