生物钟基因Bmal1调控颈动脉斑块形成及其稳定性转变的机制研究

The expression of circadian gene Bmal1 is in an organ-specific manner. In the cardiovascular system, Bmal1 involves in the plaque formation and stability shift by regulating the downstream clock-controlled genes, but the underlying mechanism is still not clear. Our previous study found that the rhythmic expression of clock genes attenuated in human plaque-derived vascular smooth muscle cells (VSMCs), and Bmal1 played an important role in the regulation of cell apoptosis and migration. Accordingly, we propose the hypothesis that the attenuation of Bmal1 expression could lead to the increasing migration of inflammatory cells into the plaque and release more reactive oxygen species. Then the apoptosis of VSMCs would increase under the oxidative stress, which could thin the fibrous cap and result in plaque rupture eventually. To verify this hypothesis, we plan to establish the models of primary cultured human plaque-derived VSMCs and normal aortic VSMCs, THP1 cells and the smooth muscle specific Bmal1 knockout mice. Then using a variety of experimental methods to verify that Bmal1 plays a important role in the plaque formation and stability shift in vivo and in vitro. Furthermore, we will clarify the mechanism of how Bmal1 regulates the cells apoptosis and migration under oxidative stress.This study will provide a new perspective on mechanisms of plaque formation and stability shift. It also provides a therapeutic way to prevent plaque formation and rupture base on a new theory.

生物钟基因Bmal1的作用具有器官特异性，它在心血管系统中通过调控下游钟控基因参与斑块形成及稳定性转变，但具体机制迄今未明。我们前期研究发现，斑块来源血管平滑肌细胞中Bmal1表达减弱，且Bmal1在调控细胞凋亡和迁移方面起重要作用。基于此，我们提出假说：Bmal1表达减弱，可使炎症细胞迁移入斑块增多，释放活性氧化物，并使血管平滑肌细胞在氧化应激环境下凋亡增加，纤维帽变薄，最终导致斑块破裂。为验证以上假说，我们将通过原代培养人斑块和正常血管平滑肌细胞、单核细胞系THP1、人斑块标本和血管平滑肌Bmal1条件性敲除小鼠模型，采用多种方法从体内外各水平验证Bmal1在调控斑块形成及稳定性转变中的重要作用，阐明Bmal1在氧化应激环境下调控细胞凋亡和迁移的具体机制。本课题将对斑块的发生及稳定性转变研究提供全新的视角，为今后抑制斑块生成和预防斑块破裂的研究提供全新的理论基础及治疗方向。

生物钟基因Bmal1的作用具有器官特异性，它在心血管系统中通过调控下游钟控基因参与斑块形成及稳定性转变。我们前期研究发现，斑块来源血管平滑肌细胞中Bmal1表达减弱，但该变化对斑块的影响尚不清楚。基于此，本课题主要研究了以下几方面内容：1.从细胞水平探究Bmal1表达减弱的原因；2.检测并分析人颈动脉斑块标本中Bmal1的表达与斑块易损性及临床症状间的关联性；3.在细胞及动物水平（Bmal1-KO和VSMC Bmal1-KO小鼠）研究Bmal1表达改变对血管平滑肌细胞凋亡及迁移的影响，以及对巨噬细胞跨内膜迁移的影响；4.通过各种分子生物学及生化实验阐明Bmal1调控细胞凋亡及迁移的相关分子机制。结果发现：1.斑块来源血管平滑肌细胞中生物钟基因表达减弱、下游钟控基因节律紊乱，至少部分是由于细胞内高胆固醇水平导致的。2.人颈动脉斑块组织标本中，症状性患者和易损斑块的Bmal1表达显著降低；多因素回归证实斑块组织中Bmal1表达降低是患者症状性和斑块不稳定性的独立风险因素。下游炎症因子中，我们发现血清TNF-α表达升高是患者症状性和斑块不稳定性的独立风险因素，且TNF-α表达升高与颈动脉支架术后颅内新发脑缺血病灶相关。3. 动物实验及细胞实验均发现Bmal1表达减弱导致血管平滑肌细胞及单核-巨噬细胞迁移至病灶增多，活性氧化物水平升高，从而导致氧化应激诱导的细胞凋亡增多，斑块病变趋于不稳定。4.分子机制实验证实：Bmal1可抑制氧化应激诱导的血管平滑肌细胞凋亡，这是通过激活抗氧化应激关键分子Nrf2和Bcl-2的表达来实现的。这样，我们就证实高胆固醇含量导致的斑块中Bmal1表达降低，会导致炎症细胞迁移至斑块部位增多，释放各种活性氧化物，促使血管平滑肌细胞在氧化应激环境下凋亡增加，斑块内坏死核心增大，纤维帽变薄，斑块趋于不稳定并最终破裂。本课题的发现，一方面为预测斑块不稳定性寻找到了相关的生物标志物，另一方面，阐明了Bmal1调控斑块稳定性的相关分子机制，为今后抑制斑块生成和预防斑块破裂提供了新的理论基础和治疗方向。