Wnt信号通路在肥厚性心力衰竭中的作用机制及基因靶向干预研究

Heart failure is the end-stage manifestation and the most important cause of death of cardiovascular disease. Although the treatment of heart failure has progressed much in the past years, the number of deaths in patients with heart failure is still increasing. Studies found that the excessive activation of the Wnt signaling pathway accelerated the process of cardiac hypertrophy and hypertrophic heart failure. Recently, we established the transverse aortic constriction (TAC) mouse model to induce hypertrophic heart failure. As the extension of the time, Wnt signaling pathway was persistent over-activated in the process of cardiac hypertrophy, but the mechanism is unclear. SFRP1 gene has negative regulatory role on the Wnt signaling pathway. Meanwhile, previous studies also revealed its angiogenic and anti-apoptotic effects. Accordingly, we intends to establish the TAC hypertrophic heart failure mouse model to investigate the mechanism of Wnt pathway in hypertrophic heart failure. Meanwhile, we constructed a recombinant AAV-9 vector carrying SFRP1gene. Via SFRP1 gene transduction, over-activation of Wnt signaling pathway can be inhibited in hypertrophic heart failure. The effectiveness and feasibility of SFRP1 gene targeting intervention and the molecular mechanisms of rAAV9-SFRP1 gene on Wnt signaling pathway inhibition and alleviation of hypertrophic heart failure can be made clear. The new measures and prevention programs for hypertrophic heart failure can be proposed.

心力衰竭是心血管疾病的终末期表现和最主要的死因，尽管心衰治疗有了很大的进展，但心衰患者死亡数仍在不断增加。研究发现Wnt信号通路的过度激活加速了心肌肥厚及肥厚性心力衰竭的过程。我们最近在主动脉弓缩窄（TAC）诱导心肌肥厚心衰小鼠模型中，发现随着建模时间的延长，Wnt信号通路在小鼠的心肌肥厚进程中持续过度激活，但是机制尚不清楚。SFRP1基因对Wnt信号通路起负调控作用，而且既往也发现其促血管新生及抗细胞凋亡的作用。据此，本课题拟建立小鼠TAC心肌肥厚心衰模型，探讨Wnt通路在心肌肥厚心衰中的作用机制；同时，构建携带SFRP1基因的重组AAV-9载体，通过SFRP1基因转导靶向抑制肥厚心肌中Wnt信号通路的过度激活，明确SFRP1基因靶向干预治疗的有效性和可行性，阐明rAAV9-SFRP1基因抑制Wnt信号通路减轻肥厚性心力衰竭发生的分子机制，提出防治肥厚性心力衰竭发生的新方法和方案。

目的：血液动力学超负荷会导致心室肥厚，进而导致心力衰竭的发生。Wnt信号通路既往被报道在心力衰竭患者中得到激活。分泌型卷曲相关蛋白1（Sfrp1）是Wnt信号通路激活的抑制子。本研究的研究目的在于探究Sfrp1对于血液动力学超载介导的心力衰竭中的保护效果的机制。.方法：我们分别建立了血管紧张素II（Ang II）药物诱导心肌肥厚的细胞模型和小鼠主动脉弓缩窄（TAC）诱导的心力衰竭模型。我们使用重组的腺相关病毒9（AAV9）作为载体将来转导SFRP1基因进入心肌细胞中及小动物体内。我们使用免疫荧光及免疫组化染色的方法来评估病毒转载的有效性。侵入性血液动力学检查被用来评估心脏收缩及舒张功能。Sfrp1、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、DVL1、c-myc、cyclinD1等Wnt信号通路关键分子表达水平用mRNA及Western blotting方法来测定。ICAM-1、Collagen I 、Collagen III、 IL-6、IL-10、TNF-a炎症及纤维化水平使用mRNA或ELISA法测定。caspase3、Bax、Bcl-2、TnI、TnT、ANP、BNP、LDH等心肌坏死水平使用Western blotting和ELISA法测定。MMP-2，MMP-9、心肌血管密度检测（MVD检测）测定血管新生情况。心肌凋亡及纤维化使用TUNEL、组织马松染色、电镜、细胞流式、细胞周期检测来测定。.结果：本研究发现血管紧张素II（Ang II）药物诱导能够成功诱导心肌细胞肥大， 且TAC模型的成功建立能导致心功能不全及心肌细胞肥厚。诱导心肌肥厚后，可见β-catenin、p-GSK3β、DVL1、c-myc、cyclinD1等Wnt通路分子信号物质mRNA表达增加，且心肌细胞中相应蛋白表达显著增加；ICAM-1、Collagen I 、Collagen III、 IL-6、TNF-a等炎症及纤维化表达显著增加，IL-10表达显著降低；caspase3、Bax、TnI、TnT、ANP、BNP、LDH等心肌凋亡及坏死标记物明显增加，Bcl-2表达显著降低；MMP-2，MMP-9增加，血管新生明显降低。TUNEL、组织马松染色、电镜、细胞流式、细胞周期检测均显示坏死及凋亡细胞显著增加。当转导入AAV9-SFRP1病毒载体后，TAC小鼠模型伴有30天生存率及心功能