大豆生育期E8基因的图位克隆与功能解析

Soybean maturity is one of the most important factors to control yield. Maturity is reflected by the photoperiod responses. Our previous studies had discovered the novel and legume-specific photoperiod regulated flowering pathway PHYA(E3E4)-J-E1-FT. We had identified multiple alleles of maturity genes E1-E4 and developed specific functional markers. Using those markers, the appropriate allelic combinations of four maturity genes for different maturity groups were characterized and identified. However, the allelic combinations of four maturity genes E1-E4 can not explain all the maturity variations in the 13 soybean maturity groups. Therefore, in this study we aim to fine map the maturity locus E8 and clone the responsible gene of E8 locus based on our developed segregation populations. Using the near isogenic lines of E8, E1, E2, E3, E4 and FT, we were able to understand the genetic regulations among these genes. The findings of this study will facilitate our understandings on soybean photoperiod regulated flowering. The mechanisms identified here will also bring us the major significances on the molecular design breeding to adapt different latitudes.

生育期是大豆产量最主要的影响因子之一，生育期的长短是由品种对光周期反应强弱决定的。我们前期原创性地发现了豆科植物特有的光周期调控开花途径PHYA(E3E4)-J-E1-FT，解析了E1、E2、E3、E4等位变异，开发了鉴定每种等位变异的方法，对我国大豆核心种质资源的E1-E4基因进行了分型，提出了适合不同纬度生态区域种植的大豆品种的E1-E4等位变异组合。然而，这四个基因等位变异所有组合并不能完全解释国际12个熟期组代表性品种的生育期。本项目拟在已经构建了遗传作图群体和次级分离群体、初步定位了E8基因位点的基础上，精细定位E8基因并图位克隆，通过基因互补及遗传实验验证其功能，利用单、双、多重突变体通过基因表达实验探讨E8与E1、E2、E3、E4、FT间的调控关系，研究结果不仅对于深入理解大豆光周期敏感性的分子机理具有重要的学术价值，而且对于分子设计适应不同纬度地区新品种具有重要的理论意义。

2010年Cober在长日照条件下，通过经典遗传学方法在两对近等基因系Maple Presto/OT98-17，OT94-47/OT02-18中，发现一个新的控制早熟的位点，命名为“E8”，并将其定位于MLG C1连锁群上Sat_404和Satt361（Chr04:12529605 bp -32617945 bp）之间。E8显性基因在长日照条件下延迟成熟，隐性基因促进成熟。Maple Presto和OT94-47携带显性E8，OT98-17和OT02-18携带隐性e8。但发现E8所用的近等基因系间基因组差异较小，导致全基因组连锁图谱难以构建。因此，E8位点一直未被克隆。.在本项目的资助下，我们图位克隆了E8基因，通过生物信息学及表达分析实验推测在E8精细定位两个分子标记区间内的E1Lb可能是E8的候选基因。利用CRISPR/Cas9技术对E8候选基因进行敲除；以W82为受体创制了E1Lb过表达植株。分别在长日照条件下（16h光照/8h黑暗）处理，在两种背景下，敲除E1Lb突变体株系均能在长日照条件下造成显著的花期提前；而过表达株系均表现出显著的花期延迟，以上结果证明了E1Lb基因能在长日照条件下调控大豆开花，表明E1Lb是E8的编码基因。进一步利用E1Lb-OE1和W82材料进行ChIP-PCR实验表明E1lb可以直接结合到FT2a和FT5a的启动子上抑制它们的转录，进而延迟大豆开花。.重测序数据发现E8基因区及启动子区域共有三个关键突变位点，组成H1、H2、H3、H4四种单倍型。单倍型起源进化分析表明H2型可能来源于H1型，在H2型的基础上出现了CDS区的碱基缺失进而产生了H3型，而H4型则是由H1型中高纬度地区的野生大豆演变而来。.中低纬度地区的野生大豆只存在H1型，而随着纬度的提高，中国北方地区及朝鲜半岛出现了H2及H3，而更高纬度的俄罗斯的野生豆中则富集了大量的H2型等位基因。.在栽培大豆中，在中低纬度地区主要富集了H1型。而在高纬度地区，H2突变型在俄罗斯、中国、日本、韩国、美国、加拿大及欧洲都有分布，在高纬度地区有明显的富集现象，而H3型则只存在于极高纬度地区。表明不论是在野生大豆还是在栽培大豆中，E8对大豆向高纬度适应都有着重要意义。研究结果为高纬度地区早熟亲本材料的遗传改良提供了理论依据和调控元件。利用E8基因优异等位变异选育了超早熟大豆新品种1个。