大豆e4a基因功能验证

我们的研究结果表明:大豆生育期E4基因是拟南芥PHYA的同源基因，通过一对E4近等基因系解析发现了E4位点第一个外显子上插入一个LTR型的反转录转座子的突变类型；通过白炽灯以低的R:FR比延长自然光至20小时处理核心种质资源，发现了164份和e4相同表型的材料但在E4位点并未插入反转录转座子；通过序列解析又发现了E4基因的第一、二个外显子上分别发生了2处和3处单碱基置换的五种突变类型，而且全部提前产生了终止密码子；通过ILD处理，发现了只有E4基因的第二个外显子末端发生了单碱基置换的突变类型(e4a)的光形态建成是有差别的。由此，我们推断e4a基因尽管提前产生了终止密码子，但其编码的蛋白是有功能的。本项目拟通过e4a基因在拟南芥中过量表达，依据T3代纯合的转基因稳定材料在白炽灯以低的R:FR比延长自然光至20小时处理，节间是否伸长以及western blot检测e4a编码的蛋白验证其功能。

申请人的前期研究结果表明:大豆生育期E4 基因是拟南芥PHYA 的同源基因，通过一对E4 近等基因系解析发现了E4 位点第一个外显子上插入一个LTR 型的反转录转座子的突变类型；在上一个面上项目(30971813)的资助下，通过白炽灯以低的R:FR比延长自然光至20 小时处理核心种质资源，发现了164 份和e4 相同表型的材料但在E4 位点并未插入反转录转座子；通过序列解析又发现了E4 基因的第一、二个外显子上分别发生了2 处和3 处单碱基置换的五种突变类型，而且全部提前产生了终止密码子；通过ILD 处理，发现了只有E4 基因的第二个外显子末端发生了单碱基置换的突变类型(e4a)的光形态建成是有差别的。在本项目资助下，通过遗传转化使e4a 基因在拟南芥中过量表达，获得了T3、T4 代纯合的转基因稳定材料；利用上述转基因拟南芥材料及大豆E4等位变异材料在连续黑暗、红光、远红光及红光加远红光条件下，测量了各处理材料的下胚轴长度、不同节的节间长度、节数、株高，以及western blot 检测，验证了e4a 的功能。在本项目的部分资助下，还发现了在调控大豆开花期方面， E1La、E1Lb与E1 的功能类似-即抑制大豆开花及成熟，E1L的表达受控于E3与E4，揭示了在光周期调控的大豆开花机制中，光敏色素A介导的E1与E1同源基因的光诱导转录起着关键作用；发现长日照下，miR156b延迟大豆开花，且受到 E1、 E2、E3 和 E4调控实现的；克隆了 microRNA172 的靶基因 GmTOE4a，功能互补实验表明 GmTOE4a 延迟大豆开花；研究发现GmTOE4a延迟从营养生长到生殖生长期的转换是在E3 和 E4 的作用下，依赖于 GmCOL1a 的表达，并且在转录水平不受 GI 同源基因 E2 的调控；进一步深入研究表明，E1、E3、E4上调表达GmCOL1a/1b，且E1 E3组合效果大于E1 E4的组合；E2上调E3、E4的表达，但下调E1的表达；GmCOL1a/1b分别上调E1、E2、E3和E4表达。在延长自然光的长日照下，突变体Gmcol1b比野生型早花；过表达GmCOL1a转基因株系晚花。这是由于FT2a 和 FT5a 的表达被E1、E2、GmCOL1a抑制造成的。我们认为，这些基因功能间存在着负反馈调控关系，进而共同协调控制大豆光周期反应和光形态建成。