间皮素靶向可视化基因载体系统的构建及其用于胰腺癌诊断治疗的评价

目前国内外对胰腺癌的早期诊断与治疗进展缓慢，缺乏有效的诊断及治疗药物，该病5年生存率小于5%。可视化肿瘤靶向给药系统集诊断、治疗及疗效的实时监测为一体，为胰腺癌的早期诊断及个体化治疗提供了新途径。本项目以胰腺癌细胞特异表达的间皮素（MSLN）单克隆抗体为靶向配体，利用阳离子隐形纳米脂质体制备技术，通过氧化USPIO外层葡聚糖羟基形成醛基，在碱性条件下与含有氨基的磷脂形成暂时性可逆性C=N双键，采用逆向蒸发法制备具有MR成像功能的、高包封率的USPIO免疫长循环阳离子脂质体载体，并通过与DNA复合开展制剂学研究，旨在构建具有高效基因转染效率、高度胰腺癌靶向、及MRI体内成像的基因传递系统，并且通过构建及转染具有胰腺癌细胞高度特异性的、含有MSLN启动子及白喉毒素A片段的重组质粒DNA，考察所构建载体系统对胰腺癌的可视化治疗效果，进行动物体内外药效评价。

项目研究目标是构建胰腺癌靶向、诊治一体的可视化脂质体基因载体系统，有效基因转染的同时，实现MR成像观测。目前，基本实现了预期目标，完成内容包括：1.成功构建了间皮素抗体表面修饰，包封USPIO的长循环纳米阳离子脂质体载体（M-USPIO-CL）,确定了基本处方及制备工艺，即采用DOPE/DC-chol/SPC-3阳离子体系，采用逆向蒸发法，通过氧化USPIO外层葡聚糖形成醛基，与氨基磷脂DOPE形成暂时性键合的方法，提高USPIO的包封率，EE%由10%提高至40.8%，该方法已获国家发明专利授权（ZL201210016124.X）。纳米表征：M-USPIO-CL稳定，粒径约180nm，zeta电位28mV，TEM观察为圆形，且大量USPIO被成功包封入脂质体内。2.建立了后插入法偶联MLSN单克隆抗体方法，电泳及共聚焦实验验证了抗体连接后的完整性和靶向性。3.将M-USPIO-CL与DNA复合进行纳米表征，当DC-Chol/DNA以质量比7-9:1复合时，粒径较小，DNA包封率较高。4. 考察M-USPIO-CL体外MR成像功能，SI随铁浓度升高而降低，计算M-USPIO-CL和USPIO的弛豫度分别为0.0572和0.0578 mM-1ms-1，M-USPIO-CL的弛豫度未显著改变，具有较好MR成像功能。5.以PANC-1细胞为模型，MTT法考察M-USPIO-CL/DNA复合物的毒性，证实毒性主要来源于DC-Chol，随DC-Chol/DNA比例增高，毒性增大。采用报告基因质粒pGPH1/GFP/Neo，考察基因转染功能，证实对panc-1细胞具有转染功能，且当DC-chol/DNA质量比为3:1时，转染效率最高。6.构建人MSLN启动子控制表达的质粒pMSLN/luc和pMSLN/DT-A，并验证了功能。7.采用panc-1细胞移植瘤模型考察动物体内MR成像功能及基因治疗效果，静注4h后，肿瘤部位SI显著降低，ΔSI 显著低于USPIO组；给药3周后，与生理盐水组比，基因治疗组呈现显著肿瘤抑制效果。综上所述，该项目成功构建了胰腺癌靶向诊治一体化纳米基因载体，并在细胞和动物水平验证了转染pMSLN/DT-A疗效，为胰腺癌早期诊断与生物治疗提供新途径。.成果：共发表SCI论文6篇，总IF23.34分，获得一项专利授权，培养2名硕士研究生，完成1篇硕士学位论文。