EphA2受体介导的靶向Wnt5a siRNA抑制胶质瘤干细胞内皮转分化及抗拟态血管生成研究

Vasculogenic mimicry plays an important role in in glioma growth, invasion and recurrence of glioma，recent evidence suggests that glioma stem cells （GCSs）participate in the mimicry vascular formation through endothelial trans-differentiation. making it a potential new target for anti-angiogenesis therapy. Our previous study found that EphA2 receptor modified nanoparticles SWL-NPs can inhibit tumor vascular mimicry effectively, which may be related to the inhibition of plasticity of GCSs. Basing on the key role of EphA2 and Wnt5a in maintaining the stem cell properties and endothelial trans-differentiation, we propose EphA2 receptor mediated siRNA nanogel targeting Wnt5a to inhibit the GCSs endothelial transdifferentiation and vasculogenic mimicry. Focusing on the endothelial transdifferentiation of GCSs and taking EphA2 and Wnt5a as targets,we construct EphA2 receptor mediated siRNA nanogel targeting Wnt5a. We hope it suppress tumor stem cells plasticity through the EphA2 / EphrinA1 ligand dependent regulation. Furthermore，guided by EphA2 receptor, the siRNA import was transfected into GCSs and the expression of Wnt5a would be knocked out to suppress endothelial differentiation of stem cell. Ultimately, by dual-targeting of GCSs ,the endothelial transdifferentiation and vasculogenic mimicry would be depressed. We apply for the project, hoping to get the reliable evidence and molecular mechanism which contributed to the inhibition of tumor stem cells endothelial transdifferentiation，providing a new strategy for anti-angiogenesis therapy of glioma.

血管生成拟态（VM）在胶质瘤生长、侵袭中发挥重要作用，最近研究认为胶质瘤干细胞（GCSs）通过内皮转分化参与形成拟态血管（VM），是抗VM治疗的新靶点。我们前期工作发现，EphA2受体修饰的纳米粒SWL-NPs可以有效抑制肿瘤VM，可能与抑制GSCs可塑性有关。本项目基于EphA2和Wnt5a分别在维持GSCs可塑性及内皮转分化上的关键作用，着眼于GSCs内皮转分化这一核心问题，以EphA2和Wnt5a为靶点，构建EphA2受体介导的靶向Wnt5a siRNA纳米凝胶，通过EphA2/EphrinA1配体依赖性调控，抑制GSCs的可塑性；进一步以EphA2为靶点，经细胞-基因递次靶向，沉默Wnt5a的表达，抑制GSCs内皮转分化，最终达到双重靶向抑制GSCs参与VM形成的目的。我们申请此项目资助，旨在获得GSCs通过内皮转分化参与VM形成的可靠证据及机制，探索胶质瘤抗血管治疗的新策略。

血管生成拟态是一种重要供瘤血管生成方式，在胶质瘤生长、侵袭中发挥重要作用，最近研究认为胶质瘤干细胞通过内皮转分化成内皮样胶质瘤细胞，参与形成拟态血管，是抗拟态血管治疗的新靶点。本研究拟探究EphA2/Wnt5a通路在胶质瘤干细胞内皮转分化中的作用及机制，并构建靶向EphA2和Wnt5a的纳米药物并研究其理化性质和功能，为胶质母细胞瘤抗血管治疗提供新策略。我们在项目开展之初，顺利构建可稳定传代的原代胶质瘤干细胞株，并利用特定条件诱导出内皮样胶质瘤细胞，为项目后续开展提供坚实的基础。项目在施行过程中，我们根据前期实验结果和最新的文献做了一些调整，将后续研究重点放在Wnt5a及下游通路上。在后续研究中，发现Wnt5a可以促进胶质瘤干细胞内皮转分化及内皮样胶质瘤细胞的拟态血管生成；下调Wnt5a后，胶质瘤干细胞内皮转分化的能力减弱，内皮样胶质瘤细胞的拟态血管生成较少；同时，在生物信息学、免疫共沉淀、免疫荧光共定位等多种实验手段的帮助下，发现Wnt5a通过作用于FZD4受体，调节GSK3β/β-Catenin通路活性，进而影响胶质瘤干细胞内皮转分化及内皮样胶质瘤细胞的拟态血管生成。我们用成熟的cRGD-DDD纳米脂质体替代SWL纳米凝胶，构建出靶向Wnt5a的cRGD-DDD纳米药物（shWnt5a@cRGD-DDD）。相对于SWL纳米凝胶，体内及体外实验证明cRGD-DDD纳米载体可以透过血脑屏障并特异性将shWnt5a投递到胶质瘤细胞内，shWnt5a@cRGD-DDD可以抑制内皮样胶质瘤细胞的拟态血管生成，延长荷瘤鼠的生存时间，对荷瘤鼠的各器官无明显毒性。综上所述，我们明确Wnt5a在胶质瘤干细胞内皮转分化及内皮样胶质瘤细胞的拟态血管生成中起到关键的调控作用，shWnt5a@cRGD-DDD可以有效抑制胶质瘤的拟态血管生成，本研究进一步探明胶质瘤干细胞内皮转分化及拟态血管生成的调控机制，为胶质瘤抗血管药物的研发提供新的靶点及方向。