一个新天然产物铁杆蒿呋喃酮苷的抗肿瘤作用及其机制研究

Artemisa sacrorum has the efficacy of insecticidal, relieving pain, convergence of pus and yellow water, sunstroke, swelling and broken ruffian. Mongolian medicine pharmacology think that the pharmacological characteristics of Mongolian medicine with broken ruffian are antitumor activities. The research group start with the screening of the anti-tumor active parts and the anti-tumor active compound Sacrifuranoglycoside was isolated from the anti-tumor active parts. Taking Sacrifuranoglycoside as the research material, firstly, the MTT method was used to study the Sacrifuranoglycoside toxicity to look for safe concentration. Again, MTT method was used to detect the inhibition of Sacrifuranoglycoside on MNK cell. At the time, the effects of Sacrifuranoglycoside on the transplanted tumor and blood cells of mice were observed by the experiment of mice transplanted tumor. Then, the mechanisms of apoptosis and autophagy of Sacrifuranoglycoside on gastric carcinoma cell were studied to understand the effect of autophagy induced by Sacrifuranoglycoside on the apoptotic pathway and investigate the molecular basis of the relationship between apoptosis and autophagy. This provided a new idea for explaining the root cause of treating significantly the lump in the abdomen disease with Mongolian medicine possessing broken ruffian and a new method for the screening of anti-tumor Mongolian medicine.

蒙药铁杆蒿，具有杀虫、止痛、收敛脓汁及黄水、制痧症、消肿、破痞之功效，是蒙古族历代和民间常用的特色蒙药。现代蒙药药理学上认为具“破痞”功效的蒙药主要药理共性为抗肿瘤活性。课题组前期研究从铁杆蒿抗肿瘤有效部位的筛选入手，从有效部位中分离得到抗肿瘤活性较强的化合物-铁杆蒿呋喃酮苷。通过生物信息和分子对接发现铁杆蒿呋喃酮苷可能作用于VEGFR和ULK1。同时，利用细胞实验发现铁杆蒿呋喃酮苷可以诱导胃癌细胞发生自噬和凋亡。在本研究中，我们拟利用多种分子药理学手段结合蛋白组学分析深入解析铁杆蒿呋喃酮苷诱导胃癌细胞自噬和凋亡的机制，并探讨自噬和凋亡之间的关系，同时在体内水平对铁杆蒿呋喃酮苷的药效和机制进行研究。这些发现可以为铁杆蒿呋喃酮苷抗肿瘤的靶点与作用机制奠定可靠的基础，为解释“破痞”蒙药治疗“痞块症”方面疗效显著的根本原因提供一个新思路。

铁杆蒿呋喃酮苷是蒙药铁杆蒿中分离得到的一个新母核二苯乙烯类化合物。铁杆蒿呋喃酮苷结构可视为二苯乙烯基本母核的二碳链（C2）被氧化并环合而成，是白藜芦醇的结构类似物，具有潜在抗肿瘤、抗炎、抗氧化等活性。为了明确其在该植物中相对含量，采用高效液相色谱法对不同来源铁杆蒿供试液中铁杆蒿呋喃酮苷的含量进行分析。为了后续实验的顺利进行，课题组采用化学法合成大量的铁杆蒿呋喃酮苷。同时，研究铁杆蒿呋喃酮苷诱导人胃癌细胞（MKN-45）发生凋亡和自噬的分子机制，探讨铁杆蒿呋喃酮苷诱导条件下凋亡和自噬相互关系的分子基础。. 铁杆蒿经石油醚-三氯甲烷（6:1）混合溶液脱脂后，药渣用乙醇提取制备供试液。采用高效液相色谱法建立不同来源铁杆蒿供试液中铁杆蒿呋喃酮苷的含量测定方法。 以茴香醛为原料，通过亲核加成、亲电取代及脱水成环反应合成铁杆蒿呋喃酮苷，并运用 NMR 法鉴定其结构式。利用 MTT 法观察铁杆蒿呋喃酮苷对MKN-45 增殖的影响；通过分组处理后，在给药 24h 后提取细胞总蛋白，应用 Western Blot 免疫印迹法检测细胞中自噬相关蛋白（LC3B 、Beclin1）和凋亡相关蛋白（BAX、BCL-2、Caspase-3）的表达水平。. 不同来源铁杆蒿中铁杆蒿呋喃酮苷含量变化范围在0.342 ~ 0.614 mg . g –1。这一结果说明铁杆蒿呋喃酮苷在铁杆蒿中相对含量较低，从该植物中制备铁杆蒿呋喃酮苷是很难的问题。通过化学合成得到了大量铁杆蒿呋喃酮苷，产率为 53%。经1 H-NMR、13 C-NMR、DEPT、HSQC、和 HMBC 图谱分析，确定其结构为 6-羟基-4'-甲氧基铁杆蒿呋喃酮-4-O-β-D-葡萄糖苷。铁杆蒿呋喃酮苷浓度在 400-1000 μmol/L 范围内作用在 24-36 h，对 MKN-45 细胞的增殖均有明显抑制作用（P<0.01）；WesternBlot 结果显示铁杆蒿呋喃酮苷可诱导 MKN-45 细胞发生凋亡和自噬，即抗凋亡蛋白 BCL-2 的表达量明显降低（P<0.01），而促凋亡蛋白 BAX 表达量则明显增加（P<0.01），蛋白 Caspase-3 的表达量明显增加（P<0.01）；自噬蛋白 Beclin1 的表达量增加（P<0.01），蛋白 LC3II/I 的比值明显增加（P<0.01）。