长牡蛎黑色素合成通路关键基因鉴定及其影响壳色多态性的分子机制

As a commercially important marine bivalves, the Pacific oyster (Crassostrea gigas) is a major global aquaculture species, ranking first in the production among all aquaculture shellfish species. In a breeding program, four lines of C. gigas with inherited steadily white, black, golden, and purple shell colors have been established through successive selection for six generations. In this study, the melanin type and precursor in shells and mantles will be identified and quantified using high-performance liquid chromatography analysis. To identify the gene and non-coding RNA (lncRNA and microRNA) mainly involved in melanin biosynthesis pathway, the transcriptome in four shell color lines will be sequenced. The genes which may play key roles in melanin biosynthesis pathway will be cloned and characterized by RACE, qPCR, in-situ hybridization, and immunohistochemical staining. RNA interference will be performed to analyze the expression and regulatory network of the genes and non-coding RNA ((lncRNA and microRNA) involved in melanin biosynthesis pathway. Through analyzing association between genetic variation in the key genes and shell color polymorphisms, the molecular base of shell coloration will be clarified. This work will benefit comprehension of the molecular mechanism of shell color variation, and selective breeding in terms of shell color traits in C. gigas.

长牡蛎（Crassostrea gigas）是世界上养殖范围最广、产量最大的海洋贝类，在我国海产贝类养殖业中占有十分重要的地位。本项目拟选用经过6代定向选育、性状遗传稳定的4种壳色（白色、黑色、金黄色和紫色）长牡蛎为研究素材，通过高效液相色谱分析，查明长牡蛎外套膜和贝壳中黑色素及其前体的种类及含量比例；通过高通量转录组分析，筛查长牡蛎黑色素合成通路关键基因及其非编码RNA（lncRNA和microRNA）；利用RACE技术，克隆黑色素合成通路关键基因，并通过qPCR，原位杂交和免疫组化方法，分析其表达特性；采用RNA干扰技术对关键基因及其非编码RNA进行功能验证及调控分析，解析关键基因在黑色素合成通路中的功能及其表达调控网络；通过黑色素合成通路关键基因遗传变异与壳色多态性的关联分析，解析壳色多态性产生的分子基础。研究结果将为揭示长牡蛎壳色形成的分子机制、培育壳色相关优良品种奠定坚实基础。

长牡蛎（Crassostrea gigas）是世界上养殖范围最广、产量最大的海洋贝类，在我国海产贝类养殖业中占有十分重要的地位。本项目进行了黑、紫、金、白和橙色5种壳色长牡蛎贝壳色素分析，发现壳黑长牡蛎黑色素含量最高，真黑素和褐黑素的比值在5种壳色长牡蛎中存在明显差异。利用组织化学染色、光镜、透射电镜技术观察了长牡蛎外套膜显微和亚显微结构，对黑色素和黑色素小体进行了定位分析，查明黑色素主要分布在中褶的内表皮，黑色素细胞中黑色素小体呈现不同状态。通过不同壳色长牡蛎miRNA转录组分析，鉴定出154个miRNA，差异表达miRNA靶基因在与壳矿化和色素沉积相关的Notch信号通路和细胞外基质受体交流信号通路显著富集。克隆分析与黑色素合成通路5个基因（TH，DCE，DDC、PO-tyr和Per），定位了9个与壳色显著相关QTLs，分析了壳黑色性状遗传模式，发现一个位点可以控制贝壳是否具有色素，且贝壳的有色素相对于贝壳的无色素为显性。通过外套膜lncRNAs的测序筛选及功能分析，筛选到427条显著性差异表达的lncRNAs，查明6个mRNAs及其潜在顺式作用lncRNAs可能影响黑色素、类胡萝卜素、四吡咯和眼色素的合成代谢，过氧化物酶及其顺式作用lncRNA在黑色素形成中具有重要作用。分析了黑色素合成的限速酶酪氨酸酶基因（Tyr)与酪氨酸酶相关蛋白基因(Typ-2)表达，发现Tyr和Typ-2基因是铜结合蛋白，均在外套膜中出现高表达，Tyr与长牡蛎壳色形成相关，Typ-2不仅参与壳色形成，还与贝壳棱柱层形成相关。通过黑色素合成中酪氨酸酶相关蛋白基因Typ-1和Typ-3的功能分析，证实Typ-1和Typ-3均参与壳色和贝壳形成。分析了黑色素合成中Mitf基因表达与功能，发现Mitf在血淋巴中高表达，在黑色素合成过程中Mitf作为调控基因通过调控酪氨酸酶基因控制黑色素形成。分析了血红素过氧化物酶（CgHPX2）基因表达模式和转录调控，阐明CgPOU2F1和CgSox5通过正向调控CgHPX2基因转录参与贝壳形成以及色素沉积，探明了酪氨酸酶基因多态性与壳色性状的关联性。研究结果为揭示长牡蛎壳色形成的分子机制、培育壳色相关优良品种奠定了坚实的基础。