外膜合成代谢相关基因对布鲁氏菌弱毒株M5-90致弱机制的影响

布鲁氏菌病是一种具有重要公共卫生学意义的人兽共患传染病。目前对布鲁氏菌毒力的分子遗传机理仍不清楚。M5-90为我国自主培育的弱毒疫苗株，由强毒M28经独特驯化方式致弱并具有良好免疫保护性。通过对M5-90基因组序列的解析发现20个与标准强毒存在差异且为移码突变的功能基因，其中9个为细菌外膜合成代谢相关基因，为了探明这些基因是否决定细菌毒力及他们在致弱机制中的作用，利用同源重组策略敲除M28 相应靶基因获得缺失突变株，然后将其与亲本株回归动物模型小鼠及专业和非专业巨噬细胞系，在体内和体外来比较M28突变株与亲本株在侵入、复制及存活能力的差异从而研究靶基因缺失对毒力造成的影响，进而确定靶基因的功能及在致弱机制中发挥的作用。.本研究为系统阐明布鲁氏菌毒力分子遗传学机理奠定重要的基础。

布鲁氏菌病（Brucellosis）是全世界广泛分布的人兽共患慢性细菌传染病。对布鲁氏菌毒力的分子遗传机理仍不清楚。M5-90为我国自主培育具有极好保护力的弱毒疫苗株，由强毒M28经传统钝感动物驯化方式致弱。通过对研究文献的解读与分析，结合布鲁氏菌强弱毒细菌在靶细胞内的转运途径的差异，推测细菌膜合成相关蛋白可能对布鲁氏菌的独毒力有重要作用。通过对M5-90基因组序列的解析发现9个与M28等标准强毒存在差异且为移码突变的功能基因，为细菌外膜合成代谢相关基因，为了探明这些基因是否决定细菌毒力及他们在致弱机制中的作用。利用同源重组策略敲除M28 相应靶基因获得缺失突变株，然后将其与亲本株回归动物模型小鼠及专业和非专业巨噬细胞系，在体内和体外来比较M28突变株与亲本株在侵入、复制及存活能力的差异从而研究靶基因缺失对毒力造成的影响，进而确定靶基因的功能及在致弱机制中发挥的作用。研究最终获得了A1103（M28-ΔA1103）和B0107 （M28-ΔB0107）的M28突变株，另外7个基因或者只获得M28单交叉突变株，或者无法进行缺失（推测可能为复制必须基因）。结果表明B0107基因对M28毒力影响显著，A1103对M28毒力影响不显著。M28-ΔB0107 和M28-ΔA1103经过20体外培养，Kanr表达稳定。小鼠体内致病性实验结果表明，M28-ΔB0107、M28-ΔA1103和M28以106CFU剂量腹腔接种小鼠，M28-ΔB0107感染组小鼠脾脏含菌量显著低于M28组（p<0.05），感染6周时，前者低于后者近10倍；而且M28-ΔB0107感染组脾脏重量也显著低于M28强毒株组（p<0.05）。M28-ΔA1103感染组含菌量和脾脏增重均无显著差异（p>0.05）。小鼠巨噬细胞系（RAW264.7）和Hela细胞中侵染能力和复制水平的试验结果表明，M28-ΔA1103和M28-ΔB0107突变株与亲本株M28相比均无明显差异（p>0.05）。.本研究首次通过实验发现，在M5-90中缺失的编码O抗原聚合酶的BM28_B0107（以下简称B0107）基因决定了布鲁氏菌M28部分毒力，是M28一个重要的毒力相关基因；通过实验证明BM28_A1103（以下简称A1103）基因是膜合成相关基因，也是布鲁氏菌复制非必需基因，对于作为重组疫苗外源基因插入靶位点或者他进行功能