Wnt/β-catenin信号通路在细粒棘球蚴绦虫节片发育中的作用及机制

Echinococcosis is an important zoonotic parasite that infected by the larval stages of Echinococcus granulosus.Since there is no effective vaccination and drugs, make the disease serious harmful to human health,and restricts the development of animal husbandry. Therefore, screening the disease vaccine candidate genes and new drug target has become the focus of the current study.As we know, adult Echinococcus granulosus was developed from protoscoleces, during the process,in turn differentiate into neck,immature proglottids,mature proglottids and gravid proglottids, which is also accompanied with the differentiation of male and female reproductive organs.The complex development process is regulated by gene expression.Wnt/β-catenin signaling played important roles in segmentation and axial patterning. Some scholars speculated that the development process may be associated with the Wnt/β-catenin signaling pathway.To prove this hypothesis, the present study intends to apply real-time PCR,whole mount tissue in situ hybridization, Western blotting and RNA interference in research of the roles which Wnt signaling pathway played in the process of Echinococcus granulosus segment development.To reveal the mechanism of Wnt signaling pathway in Cestoda segment development.Moreover,to provide vaccine candidate genes and new drug targets for prevention and treatment of Echinococcosis.

细粒棘球蚴病是由细粒棘球绦虫幼虫期细粒棘球蚴所引起的一类严重的人畜共患病。由于目前仍无有效的疫苗和治疗药物，使得该病严重危害人类健康，并制约畜牧业经济的发展。因此，筛选有效的药物和疫苗靶标是防控本病的关键。细粒棘球蚴绦虫的成虫由原头节开始发育，依次分化形成头颈节、幼节、成节和孕节，其中还伴随着雌、雄生殖器官的分化成熟。该复杂发育过程的本质是基因表达调控的结果。Wnt/β-catenin 信号通路是动物体轴发育的关键信号之一，有学者提出该发育过程很可能受Wnt/β-catenin信号通路的调控。为证实这一假说，本项目拟通过RNA干扰调控β-catenin的表达，运用实时定量、全量组织原位杂交、蛋白免疫印迹等技术探究wnt/β-catenin信号通路在细粒棘球蚴绦虫节片发育过程中的功能，为揭示该信号通路在细粒棘球蚴绦虫节片发育中作用机制提供科学依据，进而为本病的防治提供新药靶标及疫苗候选基因。

本研究采用qRT-PCR及WISH技术分析了wnt基因家族在虫体不同发育阶段及不同发育节片的差异表达及组织分布，结果表明wnt4、wnt5和wnt11A/B在原头蚴的表达水平高于成虫，而wnt1和wnt2基因的表达规律与之相反。且主要分布于原头蚴的表皮、吸盘、顶突以及口钩等部位。进一步的分析发现，wnt基因家族在虫体的头颈节、幼节、成节和孕节均有表达，且除wnt2基因外，其它基因均呈现出递减的趋势。同时在虫体的吸盘、表皮、生殖系统等部位均有分布。接着研究分别采用licl和icrt-14激活和抑制wnt/β-catenin 信号通路，结果表明当采用icrt-14抑制该信号通路时，可加快原头蚴头节外翻的进程；同时qRT-PCR和WISH的结果表明，当licl激活wnt/β-catenin 信号通路时，其正向调控因子如wnt等的表达量均有所上调，而其负向调控因子如axin等的表达有所下调；当icrt-14抑制wnt/β-catenin 信号通路时，其正反向调控因子的表达与激活时成相反趋势。最后研究采用RNA sequence技术分析了wnt/β-catenin 信号通路激活和抑制条件下原头蚴mRNA、miRNA、CircRNA以及lncRNA的差异表达情况。结果表明，当licl激活wnt/β-catenin 信号通路时，分别有152个mRNA、24个miRNA、346个CircRNA和23个lncRNA的表达发生上调，对应的下调的分子数为194、10、306和41；当icrt-14抑制wnt/β-catenin 信号通路时，其原头蚴mRNA、miRNA、CircRNA和lncRNA发生上调的分子数依次为147个、7个、327个和31个；发生下调的分子数依次为214个、22个、313个和55个。采用qRT-PCR以及WISH技术对部分差异表达因子进行了验证，结果均与测序结果一致。综上，本研究首次解析了wnt基因在虫体不同发育阶段以及不同发育节片的差异表达及组织分布规律；发现了icrt-14抑制wnt/β-catenin 信号通路可加快原头蚴头节外翻的进程；首次解析了参与这一发育过程的CircRNA和lncRNA。这些数据将为全面揭示wnt/β-catenin 信号通路在原头蚴发育中的作用及调控机制提供全新的视角，同时为发掘新的药物靶标提供科学依据。