自体内皮祖细胞移植联合三氧化二砷干预肺动脉高压的实验研究

Pulmonary arterial hypertension(PAH) is one common and serious clinical disease. There is still no effective therapies on serious PAH, especially idiopathetic PAH and Eisenmenger syndrome, though great advance has been achieved in the past 20 years. But the basic pathological characteristics are clear and common, endothelial injury and excessive smooth muscle cell proliferation. .The present research aimed at promote endothelial cell regeneration and inhibit proliferation of smooth muscle cells based on our previous method to culture enough endothelial progenitor from peripheral blood. We hope to explore a new stem cell therapy for this kind oof patients. Arsenic trioxide is expected to exert effects on proliferation inhibition since it has been found significant effects in promoting apoptosis and inhibiting cell proliferation in leukemia.

肺动脉高压(PAH)是心脏科一种常见而严重的临床病症，在过去的20年间尽管其治疗取得了很大进展，但并未能从根本上消除本病的影响，尤其是特发性PAH或艾森曼格综合征的愈后依然十分糟糕。肺动脉高压临床表现虽差异不等，但病理表现公认为肺动脉内皮损伤和平滑肌增殖亢进两种基本改变。.本课题创意利用前期研究建立的方法从外周静脉血中获取内皮前体细胞；建立稳定的野百合碱性诱导的PAH动物模型；利用内皮前体细胞能够促进内皮再生、血管新生以及可以特异性地归巢或嵌入损伤部位的潜质，将细胞Dil荧光标记后，输注移植至肺微血管病变区并联合应用抗细胞增殖药物三氧化二砷，移植中层平滑肌细胞增生。从肺血流动力学、微血管密度、血管肌性化状况、细胞代谢以及形态学变化等方面综合判断二者对肺动脉高压的治疗效应，创意探索新的PAH治疗方法。

目的 探讨应用三氧化二砷联合自体外周血来源的内皮前体细胞（EPC）移植，对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型的治疗效应及其作用机制。.比较分析肺动脉高压患儿和健康对照儿童外周血内皮前体细胞的数量和功能差异，探索外周血内皮前体细胞作为判断肺动脉高压病情生物标记物的可能性。.方法 抽取SD大鼠股动脉血，应用密度梯度离心法分离外周血中的单个核细胞，然后进行体外培养。最后将此方法收获的细胞经一系列免疫荧光染色，证实为内皮前体细胞。抽血同时腹腔注射野百合碱50mg/kg，建立肺动脉高压模型后，对比分析单独静脉注射体外培养扩增得到的自体内皮前体细胞、腹腔注射三氧化二砷与腹腔注射三氧化二砷联合细胞移植，对肺动脉高压模型大鼠的治疗效应。干预后3周，超声心动图测量三尖瓣E/A比值，评价各组动物右室舒张功能；测量右室、肺动脉压力；处死大鼠，评价组间右室肥大指数（RV/LV+IVS）差异；处理肺组织进行组织病理学和免疫组化学分析，评价肺动脉中层平滑肌细胞凋亡情况。对照组大鼠则以同样方法注入生理盐水。.对肺动脉高压患儿外周血， 以CellQuest软件进行流式细胞分析。在前向角散射光和侧向角散射光双参数点图上对淋巴细胞群设窗，收集细胞数共60，000个，分析此群统计KDR＋/CD133＋细胞的百分率。用胰酶消化，收集贴壁细胞，将同等数目的EPC接种在包被有人纤维粘连素的24孔培养板，培养30 min，以PBS洗去未贴壁的细胞，计数贴壁细胞。将EBM-2培养液加入改良的Boyden小室的下室，将2×104 内皮前体细胞悬浮在EBM-2培养液后注入上室，37℃培养24 h，刮去滤膜上面未移动的细胞，用甲醇固定，Giemsa染色，显微镜下随机选择3个视野，计数迁移到底层的细胞数。肺动脉高压患儿在接受心导管检查过程中按照标准方法抽取心腔、大血管血液标本，进行血气分析、分流量计算和肺小动脉阻力（PVR）计算。.结果 腹腔注射野百合碱2周后的大鼠建立稳定的肺动脉高压模型。单纯内皮前体细胞移植组、腹腔注射三氧化二砷组模型大鼠注入自体内皮前体细胞3周后较肺动脉高压组大鼠，肺动脉平均压和右室收缩压均有所缓解，右室肥大指数改善，右室舒张功能改善，但是左室心肌收缩力各组间无明显差异，肺小动脉管壁增厚及血管腔狭窄程度较肺动脉高压组管壁明显变薄，但仍较正常组明显增厚。管腔狭窄显著减轻，内外弹力板间距离缩