基于loop区调控机制的双果糖酐水解酶分子改造研究

Inulobiose produced in the metabolic path of inulin used by microorganisms is a potential functional edible sugar. However, the efficiency of synthesis of inuloiose by DFA-IIIase is badly low, which contributes to the lack of inulobiose and limitation of investigations of physiochemical properties and physiological functions. The loop, designated as a lid, covers the active pocket and is a critical factor affecting catalytic efficiency, of which the regulatory mechanism is unknown. Therefore, this project will reveal the regulatory mechanism of this lid and unravel the primary reason of low efficiency resulting from the lid, which completes the catalytic mechanism of DFA-IIIase. Based on this mechanism, rational and semi-rational design of the lid area, combining with site-directed and iterative saturation mutagenesis, will be implemented to obtain mutants with high efficiency of producing inulobiose. Additionally, the mechanism of enhanced catalytic efficiency will be revealed using crystallography and computational simulation technologies. This project will eliminate the detailed metabolic mechanism decomposing inulin to inulobiose by microorganisms in nature, break through critical technology of biological production of inulobiose, and promote the exploitation of inulobiose, which probably obtains novel functional sugar enhancing human health. Moreover, this project will provide theoretical and practical bases for the investigation of other enzymes a lid.

自然界中微生物代谢菊糖途径中合成的菊二糖是一种潜在的功能性食用糖，然而合成菊二糖的双果糖酐水解酶DFA-IIIase具有低效性，导致了菊二糖的匮乏和限制了其理化性质以及生理功能的探究。DFA-IIIase活性中心上方loop区（盖子）是影响催化效率的关键因素，但此盖子调控催化反应机制未知。因此，本项目拟揭示盖子调控机制，明确盖子造成催化效率低下根本原因，完善DFA-IIIase催化机理。并基于此调控机制理性和半理性设计突变位点，结合定点突变、迭代饱和突变技术进行盖子区域的分子改造，筛选获得高效合成菊二糖的突变体酶。同时，利用晶体学、计算模拟等技术揭示突变体催化效率提升机制。项目的实施将阐明自然界中微生物如何代谢菊糖为菊二糖的具体机制，突破生物制备菊二糖的关键技术，促进对菊二糖的开发，以期获得一种提高健康水平的新型功能性糖。此外，也将为其它含盖子酶的研究提供理论和实践参考。

目前，由于高能量糖的摄入导致糖尿病等疾病人数的骤增，因此开发新型功能糖保障健康是研究的热点。菊糖（菊粉）是一种廉价且优质的糖资源被广泛应用在食品工业。菊糖有多条代谢途径，包括被菊粉酶降解为益生元低聚果糖，另一条途径则被菊糖果糖转移酶降解菊糖为双果糖酐DFA-III。DFA-III有一系列生理功能，已被认证为安全可靠的食品添加剂。DFA-III能够被双果糖酐水解酶DFA-IIIase进一步转化为新型潜在功能糖菊二糖，目前有关菊二糖的生理功能未知，这主要受限于该酶催化机理的不完善以及催化效率低的缘故。菊糖代谢途径中的多种产物具有益生功能，菊二糖也是一种潜在的功能糖。因此，完善DFA-IIIase催化机理以及提升该酶催化效率是大量获得以及开发菊二糖的关键所在。本项目主要结合已有DFA-IIIase结构进行盖子区域研究，阐明盖子调控机制，完善DFA-IIIase催化机理。并通过多种生物技术手段对DFA-IIIase进行分子改造，提高DFA-IIIase的催化效率，高效合成了菊二糖。研究针对DFA-IIIase盖子和活性口袋边沿氨基酸进行分析和实验，揭示了盖子的调控作用，主要由盖子“根部”氨基酸的“铰链”作用，包括Asp378和Ala346（Val379和Val344）这些氨基酸。同时，盖子和活性口袋边沿疏水性氨基酸的作用，保证了活性口袋疏水性微环境，防止过多水分子干扰酶水解作用。另外，盖子亲水性氨基酸与活性口袋边沿氨基酸连接作用决定这盖子的开合。进一步地通过理性、半理性、随机突变技术实现了酶活和催化效率提升的突变体成功筛选，最终获得的突变体S132D/A209V/C387A活力提升到了1021%，即提高了10倍左右，其催化效率提升到了12倍。同时，研究阐明了酶活和催化效率提升机制，为DFA-IIIase工业化生产以及应用潜在功能糖菊二糖提供了技术以及理论支持。