铜转运蛋白Ctr1的作用机理研究

Copper transport protein Ctr1 is membrane protein that facilitates the cellular uptake and distribution of cuprous ions via extra-cellular capture, transmembrane delivery and intra-cellular transfer processes. The role of copper coordination in these processes is still far from fully understood. This project will focus on the NMR investigation on the copper coordination to Ctr1 and related copper proteins. The binding sites and modes of Cu(I) and Cu(II) ions will be studied using copper titration and dynamics analysis in order to understand the contribution of key residues. The coordination geometry will be studied with XAS spectroscopy. The copper transfer from Ctr1 to copper chaperones Atox1 and Cox17 will be investigated using NMR spectroscopy. The influence of cellular molecules and metal ions on these processes will be analyzed. The investigation will be also extended to the interaction of platinum and arsenic containing drugs. This study will provide unique information for understanding the role of copper coordination and protein folding of mechanism of the copper transport protein.

铜转运蛋白Ctr1是细胞跨膜摄取铜离子的重要蛋白质，通过胞外获取、跨膜运输、胞内配位转移等步骤实现铜离子的细胞摄取和分配，铜离子配位结合方式对这一过程的作用仍有待研究。本课题拟采用核磁共振为主要手段，以铜转运蛋白Ctr1为中心，研究铜离子配位与相关蛋白质的作用机制。通过铜离子滴定、弛豫参数分析的多种NMR方法获得铜离子在蛋白质中的结合位点，掌握不同价态铜离子的配位方式，结合X射线吸收谱分析铜离子的配位结构，掌握关键氨基酸残基对铜离子摄取的贡献；分析铜离子配位导致蛋白质折叠的变化，研究金属离子在Ctr1与Atox1、Cox17等铜伴侣蛋白之间的配位转移；分析比较细胞内存在的其它生物分子或其它金属离子对铜转运蛋白配位结合作用的影响，探讨Ctr1及相关铜蛋白对铂、砷等金属药物的结合作用，从金属配位和蛋白质构象等方面阐明铜转运蛋白的作用机制。

本课题开展了铜转运蛋白hCtr1的金属结合域与铜离子配位结合的研究。课题采用核磁共振为主要手段，结合其它多种谱学技术和生化实验方法，以铜转运蛋白hCtr1为中心，研究铜离子与相关蛋白质的配位作用机制。通过铜离子的NMR滴定和串联质谱分析、结合蛋白质突变研究，获得铜离子在蛋白质中的结合位点；通过NMR和CD光谱分析掌握铜离子配位以及类膜环境均可以改变蛋白质的构象，这一作用于铜离子的跨膜运输作用相关；通过X-射线精细结构（XANES）分析了一价Cu(I)和二价Cu(II)离子与hCtr1蛋白质的配位结构，掌握关键氨基酸残基对铜离子摄取的贡献，结果显示hCTR1与Cu(I)结合的配位结构为四面体结构，配位氨基酸为His2Met2，而Cu(II)的配位结构为变形四边形结构，配位氨基酸为His2MetSer；通过荧光和紫外光谱以及ITC等方法检测了铜离子与蛋白质的结合能力、以及构建氨基酸突变对蛋白质作用的影响，获得Cu(I)离子与蛋白的结合常数为log K=14.8 ± 0.1，而组氨酸突变实验表明，His22-His24和His31-His33两个组氨酸区域的组氨酸可能共同参与了Cu(II)的配位作用；在此基础上，分析了铜离子配位所诱导的蛋白质构象变化对hCtr1的N-端金属结合域与细胞膜的作用，发现一价Cu(I)离子的结合可以显著促进蛋白质与细胞膜的结合，并在活细胞中观测到Cu配位诱导hCtr1进入细胞膜的现象，从而提出了hCtr1蛋白质转运铜离子的分子作用机制；通过研究hCtr1与人血清白蛋白HSA的作用，显示HAS具有向hCtr1转运铜离子的可行性；研究了hCtr1与细胞内铜伴侣蛋白Atox1的作用，发现Atox1可以从hCtr1膜内C-端结构域获取铜离子；在此基础上，进一步研究了相关铜蛋白与金属药物的作用，验证了铂类金属药物可能通过铜转运蛋白实现药物的细胞摄取与胞内传递，这一结果与药物活性与细胞耐药有直接的关联。相关研究结果从分子水平阐明了hCtr1结合铜离子、诱导蛋白质结构变化以实现铜离子的跨膜运输、胞内配位转移的过程以及蛋白质与金属药物的作用机理。