5’UTRs及其m6A修饰在鸡肝脏GR翻译调控中的作用

Glucocorticoid receptor (GR) is a hub protein in the complex network of intracellular stress responses. The non-coding exon 1 of GR gene can be selectively transcribed into numerous mRNA variants bearing different 5’UTR. Furthermore, multiple GR protein isoforms can be produced by alternative splicing of exon 9 and selective usage of translation start sites on exon 2. It has been shown that m6A modifications occurred in the 5'UTR of some mRNAs are involved in the translational regulation. However, the heterogeneity of 5’UTR and the role of 5’UTR m6A in the translational regulation of GR in chicken liver remain unknown. In this project, we employ both in vivo and in vitro models of chronic stress, to investigate the stress-induced changes of GR mRNA variants expression and composition, in association with alterations of 5’UTR m6A and GR protein isoforms in chicken liver. Both m6A-Seq technology and gene manipulation methods will be used to reveal the heterogeneity of 5’UTR and the role of 5’UTR m6A in the translational regulation of GR protein isoforms in chicken liver. The outcome of this project will add new knowledge on chicken GR regulation and provide supply ideas for the prevention and treatment of stress-induced metabolic disorders and immune suppression.

糖皮质激素受体（GR）是细胞应激反应网络中最重要的枢纽分子。GR非编码外显子1的选择性转录可生成多种5’UTR不同的mRNA变体，外显子9的可变剪接以及外显子2不同翻译起始位点的使用又可产生多种GR蛋白亚型。研究表明，发生在mRNA 5’UTR上的m6A修饰参与蛋白翻译调控。然而，鸡GR mRNA 5’UTR的异质性及5’UTR m6A修饰在GR翻译调控中的作用尚未见报道。本项目拟采用鸡慢性应激的在体模型和原代肝细胞体外应激模型，分析应激状态下肝脏GR mRNA 变体的表达及组成（异质性）、5’UTR m6A修饰，以及GR蛋白亚型的表达和组成的变化，并分析这三者之间的关联。通过m6A-Seq分析和基因操作，深入研究肝脏GR 5’UTR的异质性以及5’UTR m6A修饰在GR翻译调控中的作用及其机制。研究结果将从理论上丰富对鸡GR表达调控的认识，并为筛选安全有效的选择性GR调节剂提供线索。

糖皮质激素受体（GR）是细胞应激反应的枢纽分子。哺乳动物GR存在多种5’UTR转录本变体。此外，哺乳动物许多基因mRNA的5’UTR上的m6A修饰参与蛋白翻译调控，而禽类GR mRNA是否存在5’UTR变体，是否存在m6A修饰，以及m6A是否参与GR翻译调控均不清楚。本项目首先采用5’-RACE对鸡GR mRNA的5’UTR进行了克隆鉴定，发现与哺乳动物不同，鸡GR mRNA 5’UTR并不呈现明确的异质性。我们采用皮质酮处理模拟慢性应激诱导鸡脂肪肝，发现肝脏GR mRNA和蛋白均显著上调，m6A-Seq发现GR mRNA 5’UTR存在单个m6A峰，但不受皮质酮影响。皮质酮处理导致GR分子伴侣热休克蛋白HSP90B1 mRNA升高，而蛋白水平下降。m6A-Seq分析发现HSP90B1转录本存在m6A修饰，皮质酮处理导致HSP90B1 mRNA的m6A修饰水平升高。我们通过荧光素酶报告系统，结合单点突变，验证了HSP90B1 mRNA上的m6A位点起到抑制翻译的作用。因此，在皮质酮诱导的鸡脂肪肝模型中，m6A修饰并未直接参与GR翻译的调控，但可能通过HSPs间接调控GR的功能。我们随后进一步探索了GR作用的靶基因及其与m6A的关系。我们对m6A-Seq数据库进行深入挖掘，筛选了m6A受皮质酮调控的脂合成相关基因，并在原代鸡胚肝细胞的体外模型上验证了m6A的功能，揭示了GR通过转录激活m6A去甲基化酶FTO，下调SREBP-1和SCD等脂合成相关基因3’UTR的m6A修饰，从而促进其蛋白翻译的信号通路。该研究澄清了对鸡GR转录本变体的认识，揭示了m6A修饰通过HSPs调控GR，而GR又通过转录激活FTO调控m6A介导的脂合成基因的翻译，从而导致肝细胞脂肪沉积的信号通路，拓展了对鸡GR功能及其调控的认识。