波导耦合SERS结构用于细胞膜的原位动态超分辨化学成像研究

Cell membrane structure and function have always been hot topics in cell-related studies. Sofar, it is still challenging to realize in situ analysis of cell membrane. It is difficult to provide molecular information cell membrane at the molecular level by the existing in-situ analysis techniques (e.g. total internal reflection fluorescence microscopy, atomic force microscopy, single particle tracking, and cell patch clamp, etc.).This project plans to build a surface enhanced Raman scattering (SERS) - stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) system based on the excitation of the waveguide-coupled evanescent field (WEF). This system adopts the tunable waveguide resonance to couple the plasmonic resonance of a large-area metal nano array structure with high density of hot spots. This novel excitation way provides high light harvesting efficiency, which allows for high imaging sensitivity and reduces the processing difficulty for SERS substrates. The system can observe the cell membrane in the evanescent field, and can obtain the dynamic SERS information of the cell membrane in situ, avoiding the auto-fluorescence interference of the cell body and improving the imaging contrast. With the method of chemical imaging, the component distribution on the surface of the cell membrane can be tracked. Moreover, based on the principle of STORM, the super-resolution image visualization of the dynamic change of cell membrane components can be realized. By spectral analysis, cell membrane structure can be investigated from molecular level, as well as the feedback of cell to drug stimuli.

细胞膜结构与功能一直是细胞研究的重点和热点，但细胞膜的原位分析技术还非常有限。现有的细胞膜原位分析技术（全内反射荧光、原子力显微镜、单颗粒示踪、细胞膜片钳等）都很难提供细胞膜分子水平上的信息。本项目计划搭建一套以波导耦合消逝场（WEF）激励的表面增强拉曼散射（SERS）-随机光学重构（STORM）系统。该系统采用角度可调谐的波导共振，来耦合大面积的热点型金属纳米阵列结构的等离激元共振。这一新颖的光谱激励方式提供了高效光捕获效率，具有较高的灵敏度，同时降低了SERS基底的加工难度。在消逝场下观测细胞膜，可获得细胞膜的动态原位SERS信息，避免了细胞体相自发荧光干扰，提高成像反差。采用化学成像的方式，对细胞膜表面的组分分布进行跟踪，并基于STORM的原理，还原细胞膜上物质超分辨图像，可视化细胞膜组分的动态变化；跟踪细胞膜结构光谱，通过光谱解析从分子层次认识细胞膜结构、了解细胞对药物刺激的反馈。

细胞膜作为细胞结构的重要基础，在维持内环境稳定、与外界进行物质交换和信息传递等方面发挥重要作用。了解细胞膜上的脂质、糖及膜蛋白对于药物设计，疾病治疗等研究具有重要价值。由于跨膜蛋白具有亲水性-亲脂性杂化结构域，难以溶解于溶剂中进行纯化和结晶，已有的蛋白质表达纯化技术在膜蛋白研究中难于适用。此外，膜蛋白在磷脂上分布呈不对称性，且与脂阀、糖链形成动态的组装体，协同行使功能。因而，能实现对细胞膜原位观测具有重大意义。基于标记技术的荧光成像在膜蛋白研究中应用广泛，但也存在一定问题，如细胞膜染料容易被内吞、需要长时间的染料共孵育，都会对细胞产生不良影响。因此，亟待发展全新的细胞膜的原位分析技术。本项目以细胞膜原位动态研究为出发点，设计和发展了一系列体外细胞膜检测平台以及原位动态检测方法，发展和建立多种独特的表面增强拉曼散射（SERS）结构和分析技术，实现对细胞膜蛋白的免标分析和原位探测，从而为细胞膜蛋白的研究提供了实验依据和新的探索途径。取得的结果包括：1)发展大面积、高密度阵列型SERS热点结构，与波导增强消逝场激发方式配套；2)制备合成膜蛋白靶向SERS/荧光多模式探针，用于细胞膜的SERS结构分析和成像分析；3)搭建了全内反射激发模式的表界面灵敏检测设备；4)建立膜/蛋白互作模型分析平台；5)对细胞膜表面相关生化事件进行分析检测，建立药物作用下细胞膜蛋白动态表达原位评价方法；6)建立基于细胞膜蛋白表面工程化的单细胞分析技术。本项目研究充分利用光谱解析，帮助人们从分子层次认识细胞膜结构、探索膜蛋白工程化方法、了解药物刺激形成的膜蛋白反馈，有望成为膜蛋白相关研究的有力工具。本项目资助发表论文34篇，会议论文14篇，专利4项（2项授权，2项申请）；资助硕博毕业论文14部；资助国内国际会议16次，相关内容作邀请报告10次。