琥珀酸受体GPR91调控细胞药物外排和DNA损伤修复导致神经母细胞瘤多药耐药作用机制的研究

Multidrug resistance (MDR) of tumor cells is an important reason of the chemotherapy failure for neuroblastoma（NB）, and tumor cells usually increase drug efflux and the activate DNA repair leading to MDR. It is important to study the molecular mechanism to improve the prognosis of NB. In the previous work, we screened out G protein coupled receptor 91 (GPR91) as the candidate of our study. We found that the chemoresistant NB cell line SK-N-BE(2) showed higher GPR91 expression. Inhibiting GPR91 in SK-N-BE(2) cells led to sensitivity increasing for adriamycin, and the intracellular concentration of adriamycin increased as well as γH2AX(DNA damage marker). The tissue microarray results of 42 patients with NB suggested that the longer course of chemotherapy, the higher expressive intensity of GPR91. These above indicated that the protein GPR91 is probably to be involved in the NB chemoresistance process. Thus, based on the current theories, we assume that GPR91 might promotes MDR of NB tumor cells by regulating drug efflux and DNA damage repair, and we will systematically explore the machanisms. This project will provide a novel insight into the drug resistance of NB with the aim to improve the individual therapy and prognosis of the children with NB.

多药耐药（Multidrug resistance，MDR）是神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）治疗失败的主要原因之一，肿瘤细胞往往通过外排药物和激活DNA损伤修复机制来抵抗化疗，因此从以上两方面深入研究相关机制具有重要意义。前期工作中，我们筛选出G蛋白偶联受体91（G protein coupled receptor 91，GPR91）作为研究对象，预实验发现：NB耐药细胞高表达GPR91蛋白，抑制GPR91之后，细胞药敏增强，同时胞内阿霉素含量和DNA损伤标志物表达增加。组织芯片结果则提示：化疗疗程越长，GPR91表达强度越高。这表明该蛋白很可能参与了NB细胞的MDR。据此，结合现有的相关理论，本项目将系统研究GPR91通过促进药物外排和增强DNA损伤修复双重调控并促进MDR的作用和机制，为克服或延缓NB的临床耐药，改善个体化治疗方案，提供新的方向与理论。

项目背景：神经母细胞瘤（Neuroblastoma，NB）是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤，中晚期和高危组患儿预后差。研究证实，治疗过程中出现的化疗药物耐药，进而肿瘤复发和/或转移是治疗失败的主要原因之一。近年来，G 蛋白偶联受体家族在多药耐药中的作用逐渐显现，GPR91是G蛋白偶联受体家族的重要成员，新近研究发现，GPR91在多个恶性肿瘤中呈高表达，且和预后密切相关，根据前期实验结果，我们遴选了G蛋白偶联受体91（GPR91）作为研究对象，拟探讨该蛋白在NB耐药过程中的作用。..主要研究内容：利用两个独立的NB公共数据库平台，评估GPR91对NB进展和预后的影响。结合组织芯片、免疫组化技术，分析42例NB临床样本中GPR91的表达水平和临床病理特征、化疗疗程及预后的关系。接下来，在细胞学水平，利用CRISPR/Cas9敲除GPR91和过表达GPR91，联合化疗药物阿霉素（DOX）和顺铂（CDDP）干预，深入探讨GPR91对NB细胞耐药、增殖和凋亡的影响极其可能的作用机制。最后，利用荷瘤鼠实验，在活体水平进一步验证GPR91的相关作用。..重要结果和关键数据：NB数据库以及组织芯片分析表明：GPR91高表达的患儿具有较低的总体生存率和无事件生存率，GPR91表达水平和患儿的多种预后危险因素如临床INSS分期、淋巴结转移、肿瘤分化状况等密切相关；在细胞学水平，敲除GPR91可增加NB细胞对DOX和CDDP的敏感性、抑制NB细胞的增殖、促进凋亡，且该现象和促凋亡相关蛋白的表达上调有关；相反，过表达GPR91则会降低NB细胞对化疗药物的敏感性，造成相反的生物学效应。通过RNA-seq结合生物信息学技术，我们筛选了其中可能介入调控的分子通路。深入的机制探究发现：GPR91敲除后，ERK通路被抑制，DNA损伤通路被激活；反之，如果过表达GPR91，上述通路相关分子表达有相反的变化。活体实验亦初步证实，GPR91敲除后，抑制了NB肿瘤的增殖，并增加了肿瘤对DOX的敏感性，即同对照治疗组相比，GPR91敲除组获得了更为明显的减瘤效果。..科学意义：本研究揭示了GPR91是影响NB患儿预后的重要危险因素，GPR91的表达和NB临床特征密切相关，其可能通过调控DNA损伤相关通路和ERK通路，影响NB细胞的化疗敏感性、调控NB细胞增殖和凋亡。GPR91有望成为化疗耐药患儿治疗的新靶标。