DNA损伤的电化学发光传感检测方法与应用研究

DNA carries the vital information for the survival and development of life. Its integrity and stability is of utmost importance. However, DNA damage occurs during normal physiological processes or foreign invasion. Studies on DNA damage including types and amount of DNA damage, its temporal/spatial distribution in cells and repair processes are the current topics in molecular biology and molecular toxicology. This project aims to develop electrochemiluminence sensors for the detection of DNA damage. Highly specific chemical tags for 8-oxodGuo, abasic sites and methylated DNA will be designed, and then used to label these damage sites with biton-avidin ECL labels so as to achieve highly selective and sensitive detection of DNA damage products.Sensor arrays will be fabricated for the simultaneous detection of multiple types of DNA damage products. The developed sensor will be employed in the investigation of toxicity mechanisms of carcinogenic chemicals.

DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维护DNA分子的完整性和稳定性对细胞至关重要。然而，在生命体的正常生理过程中，或者生命体受到外来物质的入侵后，常常发生DNA分子的损伤或改变。对DNA损伤的研究，包括DNA损伤产物的种类、数量、时空分布、修复过程与效率等等，是当今分子生物学和分子毒理学的研究热点问题之一。本项目拟在前期DNA光电化学传感器工作的基础上，研究DNA损伤的电化学发光检测方法。针对8-羟基脱氧鸟苷、碱基缺失、甲基化碱基等代表性DNA损伤产物，采用特异性化学标记，结合DNA修复酶，引入电化学发光信号分子，实现DNA损伤产物的高选择性、高灵敏度检测。设计基于电极微孔板的阵列传感器，实现多种损伤产物的同时检测。利用建立的传感方法，研究DNA修复酶对DNA损伤位点的修复机制，并考察致癌化合物对DNA修复酶活性的抑制效应，探讨其致癌毒性的分子机理，为分子毒理学提供新的研究手段。

DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维护DNA分子的完整性和稳定性对细胞至关重要。然而，生命体受到外来物质的入侵后，常常发生DNA分子的损伤或改变。对DNA损伤的研究是当今分子生物学和分子毒理学的研究热点问题之一。本项目拟研究DNA损伤的电化学发光检测方法。针对8-羟基脱氧鸟苷(8-oxodG)、碱基缺失(AP)、甲基化碱基等代表性DNA损伤产物，采用特异性化学标记，结合DNA修复酶，引入电化学发光信号分子，实现DNA损伤产物的高选择性、高灵敏度检测。. 我们首先针对8-oxodG这个DNA氧化损伤的标志物，设计合成了一个具有识别与信号双功能的化学探针精胺-钌，以此构建了可以特异性检测8-oxo-dG的电化学发光传感器，从500个正常碱基中检测出1个8-oxo-dG。利用该传感器检测出Fenton试剂对DNA损伤产生的8-oxo-dG，并实现了定量分析。还利用该传感器评估了重金属对DNA修复酶Fpg活性的影响，发现Hg2+和甲基汞显著抑制Fpg的活性，存在明显的剂量-效应关系。. 针对碱基缺失AP这个DNA氧化损伤的常见产物，我们利用醛式反应探针ARP对AP位点进行生物素标记，然后通过生物素-链霉亲和素进行信号标记，实现了AP位点的电化学发光传感检测。传感器能从512个碱基中检出1个AP 位点，检测下限达到2.8 fmol。传感器对8-oxodG、甲基化碱基等其他DNA损伤产物没有响应，显示出很好的选择性。利用该传感器可以评估DNA烷基化试剂对DNA的损伤情况。. 为了实现DNA损伤产物的高通量检测，我们制备了带有内置电极的96孔板，在微孔板底部固定核酸膜，结合精胺钌双功能标记物，构筑了检测8-oxodG的电化学发光传感器阵列,能够检测出500个正常碱基中的1个8-oxodG，信噪比约3.5倍，相对标准偏差低于17%，而且阵列中96个传感器的信号检测在2分钟内自动完成。利用这个装置，发现垃圾焚烧飞灰的有机溶剂提取液中存在能导致8-oxodG产生、具有潜在基因毒性的化合物。. 总而言之，我们的工作建立了8-oxo-dG、AP等多种DNA损伤产物的电化学发光定量检测，方法具有特异性，并依托电极微孔板实现了高通量检测，为化合物基因毒性的快速筛查提供了一个有效的工具。