PNLDC1在精子发生过程中的功能研究

10%-15% of childbearing couples facing reproductive problem. Recent study revealed that piRNA plays a unique role in regulation of spermatogenesis. Biogenesis pathway of piRNA is a hot topic in biological scientific field, but the enzymes that mediate 3’ processing of mammals piRNAs are still unknown. In our human testicular proteomics research, we focus on an exonuclease, PNLDC1. PNLDC1-null male mice were infertile and azoospermia; LINEs of retrotransposon were expressed in PNLDC1-null testis 10 days after birth, which suggested a functional defect of piRNA; RNA sequencing reveals that length distribution of piRNA is changed. These results suggested that PNLDC1 is involve in biogenesis pathway of piRNA. We will find cellular location of PNLDC1; look for components of PNLDC1-RNA complex; and analyze piRNA and mRNA changes in PNLDC1-null testis. Our study could provide an overall view of PNLDC1 in regulation of spermatogenesis.

在育龄夫妻中有10%-15%面临不孕不育,一直困扰着诸多家庭。近年来随着男性不育机制研究的深入，发现piRNA在精子发生过程中发挥了重要作用。近年来，探究piRNA的形成过程一直是生命科学领域的热门话题，然而科学家们迟迟没有阐明piRNA的3’端剪切机制。我们关注到PNLDC1特异性的表达于睾丸中，可能作为一个核酸外切酶发挥作用。进一步构建了PNLDC1敲除小鼠模型，发现缺失PNLDC1的雄鼠不育；反转录转座子表达蛋白质LINE1检测发现，缺失PNLDC1的小鼠出现piRNA功能受损；对雄鼠睾丸测序发现，敲除小鼠睾丸piRNA长度出现异常，高度提示PNLDC1是哺乳动物中参与piRNA剪切成熟的关键酶。本课题拟通过明确其睾丸中精确的细胞定位；筛选和验证PNLDC1参与蛋白质-RNA复合体；通过分析PNLDC1缺失后piRNA生成过程的影响以及mRNA的改变，从而全面阐明PNLDC1的功能。

精子发生过程可以划分为四个阶段：原始生殖细胞迁移入生殖嵴、精原细胞有丝分裂及分化、减数分裂及精子变形。精子发生障碍是雄性不育的重要原因之一。维持精子基因组的完整性对遗传信息的正确传递具有重要的意义。非编码小RNA对精子发生的调控作用一直是生殖医学领域的研究热点。piRNA与PIWI蛋白结合形成piRNA介导的沉默复合体（piRNA-induced silencing complexes, piRISC），对转座子进行沉默，维持生殖细胞基因组的完整性。然而，哺乳类动物Pnldc1的具体功能还未有报道。本研究中，我们尝试对小鼠Pnldc1的分子功能及其对精子发生的影响进行了探究。我们通过real-time qPCR技术对小鼠Pnldc1的表达模式进行了分析。小鼠Pnldc1为睾丸特异性表达基因。出生后1-3周，小鼠睾丸中Pnldc1的表达水平持续升高。在出生后4周-8周，小鼠睾丸中Pnldc1的表达水平逐渐下降。我们利用CRISP/Cas 9技术构建了Pnldc1特异性敲除小鼠。Pnldc1纯合敲除小鼠附睾中无正常精子，睾丸减小，雄性完全不育。正常情况下，生精细胞中的转座子都受到piRNA调控而处于沉默状态。转座子的异常激活往往提示piRNA生成出现障碍。我们对Pnldc1敲除小鼠生精细胞中piRNA通路相关蛋白的表达情况进行了分析，发现敲除鼠中MILI、MIWI、TDRD1以及TDRKH的定位出现了异常极化。综上所述：小鼠Pnldc1参与piRNA中间体 3’末端截短过程，并可通过某种方式调节MIWI蛋白的表达。Pnldc1敲除后，3’端延长的piRNA对精子发生的调控能力发生改变，最终导致精子发生障碍和雄性不育。