对虾转录激活反应RNA结合蛋白与真核翻译起始因子6在对虾抗病毒防御中的作用

近年来的研究证明，RNA干扰在对虾抗病毒免疫中具有重要作用，但多数研究都是对抗毒现象的观察报道，对其抗病毒机理还不清楚。本项目是在我们前期工作发现的与抗病毒相关的两种蛋白，转录激活反应RNA结合蛋白(TRBP)和真核翻译起始因子6 (eIF6)进行研究的基础上提出来的。通过表达这两种蛋白的不同的结构域和突变体研究这两种蛋白相互结合的分子机理，TRBP与双链RNA结合的性质。利用pulldown和亲和层析等方法分析两种蛋白与对虾RNA干扰途径中的RNA诱导沉默复合体的其他组分的相互作用，干扰掉这些蛋白后对对虾体内病毒繁殖的影响等。通过本项目的实施，为对虾抗病毒的机理的阐明提供资料，为对虾养殖中病毒病的防治提供新思路。

转录激活反应RNA结合蛋白(Trans-activation response RNA-binding protein，TRBP) 是一种多功能蛋白，在多种生命进程中发挥重要作用。我们在前期研究中从中国明对虾中克隆得到TRBP和eIF6, 发现它们之间可以相互作用，参与了对虾的抗病毒免疫。为了进一步研究其功能，我们利用实验室内易于养殖的日本囊对虾进行了系列功能研究工作。克隆得到了3个TRBP基因和1个eIF6基因。TRBP编码的蛋白具有3个双链RNA结合结构域。我们对TRBP的不同结构域进行重组表达。pull down实验证明TRBP结构域B和C介导与eIF6的结合。Gel-shift结果表明TRBP结构域A对dsRNA具有很高的亲和力，而结构域B亲和力很弱，结构域C不结合dsRNA，但可通过介导TRBP全长分子的二聚化提高TRBP分子的亲和力。RNAi结果表明TRBP和eIF6参与dsRNA介导的RNA沉默，沉默TRBP和eIF6均可影响对虾的RNAi的效果，但都可以促进WSSV的增殖。这些结果表明，TRBP和eIF6可能通过抗病毒RNA沉默途径参与对虾抗病毒免疫。我们还利用蛋白质组学的方法，筛选了参与对虾抗病毒免疫的相关蛋白，发现有60种蛋白质在病毒感染后有其表达模式显著的改变，包括泛素结合酶E2、Rab GTP酶和14-3-3-样蛋白等。. 除此之外，我们发现泛素结合酶E2可以泛素化白班综合症病毒的Ring结构域蛋白，并抑制病毒的复制。对参与对虾免疫的模式识别受体如C-型凝集素、效应分子如抗脂多糖因子和溶菌酶、信号转导和转录激活子（STAT）、丝氨酸蛋白酶及其同系物、活化蛋白激酶C1受体和Rap GTP酶等进行性质和功能研究。