APOE基因多态性性对神经元/胶质细胞创伤耐受性的影响及机制探索

创伤性脑损伤后以细胞凋亡为主要特征的继发性脑损伤是影响伤情转归的主要因素。载脂蛋白E基因(APOE)主要有ε2、ε3、ε4三种等位基因，我们前期工作和国外研究显示,APOE基因多态性与继发性脑损伤密切相关，但是，APOE影响脑损伤病情转归的机制尚未阐明。NMDA受体是介导Ca2+内流的重要环节，本课题以APOE亚型特异性与NMDA受体的关系作为切入点，建立APOE转基因鼠及敲除鼠原代神经元/胶质细胞共培养体系，构建神经元/胶质细胞横断划痕模型，检测伤后APOE蛋白表达的变化及细胞凋亡指数改变;采用全细胞膜片钳与单细胞荧光定量PCR同步技术，定性及定量分析伤后APOE亚型特异性与NMDA激活电流、细胞凋亡的关系，并结合动物实验，探索APOE影响继发性神经细胞损伤的作用机制。

载脂蛋白E（Apolipoprotein E, APOE表示其基因，apoE表示其编码蛋白）基因主要有ε2、ε3、ε4三个等位基因，我们前期工作和国外研究显示,APOE基因多态性与继发性脑损伤密切相关，但是，APOE影响脑损伤病情转归的机制尚未阐明。本课题从4个方面对相关机制进行了探索。1. 构建3种APOE等位基因的重组质粒，并分别转染星形胶质细胞，并建立细胞的划伤模型，通过Western Blot、RT-PCR、激光共聚焦显微镜技术比较了3型细胞伤后p38MAPK-NF-κB炎症信号通路的差异。实验结果发现，伤后早期APOEε4星形胶质细胞NF-κB高表达及由此造成的细胞内Ca2+浓度升高显著高于其他两型细胞，且APOEε4表达p38MAPK显著高于其他两型细胞，这可能是其参与影响TBI后炎症反应，并导致TBI不良预后的原因。2. 通过培养原代神经元和星型胶质细胞并构建机械损伤模型，检测不同亚型apoE蛋白对细胞内Ca2+水平、神经元内线粒体功能以及星型胶质细胞释放谷氨酸的影响，实验结果发现，与apoE2和apoE3相比，apoE4能够导致Ca2+和Glu释放水平明显增加，并使神经元线粒体膜电位明显下降，这可能是APOE基因多态性影响TBI预后的机制之一。3. 以APOE转基因鼠（ε3、ε4）、APOE敲除鼠及APOE野生鼠为研究对象，以PSI颅脑损伤撞击器精确打击制备TBI模型，通过检测伤灶皮层中的大分子伊文思蓝（EB）和小分子荧光素钠（NaFI）含量来评价BBB通透性的变化，同时通过干湿重法测定脑组织含水量；伤后7d采用western blot法及qRT-PCR法检测不同APOE基因型鼠损伤灶脑微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白occludin及Claudin-5的表达及转录。实验结果发现，APOE在维持BBB正常功能及损伤后BBB的修复过程中发挥了重要作用，ε4在维持BBB正常通透性及损伤后修复两方面均明显减弱，通过作用于紧密连接的修复进而影响BBB损伤后的修复。4. 此外，我们还探讨了apoE蛋白对神经元轴突再生及生长锥生长的影响以及在损伤后神经元中的变化及调节机制；从继发性脑损伤的角度探讨了apoE蛋白对星形胶质细胞缺氧性损伤的保护作用及相关机制，为后续从apoE角度临床干预继发性脑损伤的研究奠定了实验基础。