PDE10A对特发性肺纤维化的调控及其分子机制研究

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a severe, chronic and fatal lung disease, and there is no effective clinical therapy recently. PDE10 is a novel member of phosphodiesterase (PDE) family, with bisubstrate(cAMP/cGMP) characteristics. The genetic data from IPF patient suggested that PDE10 expression were significantly increased. Our recent studies also showed that PDE10 expression was significantly increased in the development of lung fibrosis, and papaverine (PDE10 selective inhibitor) significantly inhibited bleomycin-induced lung fibrosis. So, we speculated that PDE10 is a new IPF-related genes. This topic from IPF patient and animal models suggested that PDE10 participate in the process of pulmonary fibrosis, So, in this study, bleomycin-induced pulmonary fibrosis mice model and lung cells will be used, by immunohistochemistry, WB, immunoprecipitation, siRNA, TGF-β transformation and PDE10 inhibitors, we will analysis the expression and distribution of PDE10A in lungs and its role in EMT, smooth muscle proliferation and related signaling molecular. Then we will verify the mechanisms in PDE10A knockout mice. Thereby our work will clarify the regulation of PDE10A on pulmonary fibrosis and the specific molecular mechanisms. Our work not only provides a new view in the mechanism of pulmonary fibrosis, meanwhile provide a new direction of research and development of new drugs for IPF therapy.

特发性肺纤维化（IPF）是一种严重的慢性发展致死性的肺疾病。目前尚无有效治疗方法。磷酸二酯酶10（PDE10）是具有双底物特性的PDE亚型。已有IPF病人基因数据库信息提示PDE10A表达明显上调。本研究小组的预实验也证实PDE10A在小鼠博莱霉素诱导的肺纤维化进程中表达明显增加，其特异性抑制剂罂粟碱能明显抑制此肺纤维化进程。由此，我们推测PDE10A可能是一个新的IPF相关调控基因。本研究拟采用博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型及通过培养肺组织结构细胞，采用免疫组化、WB、免疫沉淀、siRNA、TGF-β转化及PDE10抑制剂干预等方法，分析PDE10A在肺部的表达与分布及其在EMT、平滑肌增殖中的作用和相关信号通路；进一步通过PDE10A基因敲除小鼠进行验证，从而阐明PDE10A对肺纤维化的调控及分子机制。这不仅为肺纤维化的机制研究提供新的视点，同时对IPF新药的研制和开发也具有指导意义。

研究背景：我们的初步研究发现PDE10A的表达量在博来霉素诱导的肺纤维化中明显增加，因此，我们通过体外和体内实验探讨抑制PDE10A表达的罂粟碱对于肺纤维化的治疗作用。 研究方法：在体外实验中，我们采用TGF-β1来处理不同的成纤维细胞建立成纤维细胞-肌成纤维细胞转化的体外细胞模型：分别给与罂粟碱和吡非尼酮30min后，再给与TGF-β1诱导48h。检测成纤维细胞肌化表型标志物（如α-SMA，I型胶原，纤维连接蛋白）的表达。再通过免疫印迹明确其抗纤维化的相关机制。在体内实验中，通过博莱霉素气道滴注C57BL/6N小鼠来诱导肺纤维化模型。分别从第1天到14天以及从第7天到21天腹腔注射PDE10A抑制剂罂粟碱。通过masson三色染色法来检测胶原沉积。通过组织免疫荧光法检测α-SMA的表达含量以及位置来阐述罂粟碱的靶标细胞以及相应的效应，检测经典的纤维化细胞信号通路如p-smad2/3,-catenin通路蛋白确认具体作用途径。研究结果：体外研究中，实时定量PCR确认TGF-β1诱导的成纤维细胞的肌化在48h最明显；在人肺成纤维细胞HFL-1和 MRC-5中，通过免疫荧光检测肌化指标α-SMA，提示罂粟碱（100M）能显著抑制由TGF-β1诱导的成纤维细胞的肌化如α-SMA，I型胶原和纤维连接蛋白的增加，而同等剂量的吡非尼酮没有效果，且罂粟碱处理能明显降低由TGF-β1诱导的-catenin表达含量的增加，且并非是通过减少-catenin的核转移而是减少了在胞浆内的表达含量；同时罂粟碱对经典的TGF-β1通路中的磷酸化的smad2/3没有影响。另外，在胚胎小鼠中分离的成纤维细胞MEF中，通过免疫荧光与WB再一次确认了罂粟碱对肌成纤维细胞活化的抑制作用。在体内实验中，通过masson三色染色实验，结果显示在预防组与治疗组采用腹腔注射罂粟碱（10mg/kg）后均能明显抑制由博来霉素（2.5mg/kg）诱导的肺间质上纤维胶原的积聚。另外，组织免疫荧光结果显示罂粟碱能明显减少在肺间质细胞中博来霉素诱导的a-SMA的增加以及通路分子-catenin的表达。研究结论：本研究的结果提示罂粟碱能抑制由TGF-β1诱导的肌成纤维细胞活化以及减弱由博来霉素诱导的肺纤维化。提示了罂粟碱抑制纤维化具有一定的前景，而且机制可能涉及 TGF-β1/-catenin通路。