家蚕BmNPV出芽型病毒囊膜蛋白GP64受体蛋白的分子鉴定

The Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) is a specific pathogen to infect silkworm.During the baculovirus infection cycle,it produces two types of virions, budded viruses (BVs) and occlusion-derived viruses (ODVs).ODVs cause oral infection when the host ingested the viral occlusion,While BVs are responsible for systematic infection within the silkworm. GP64 is the most important envelop protein in BV and was proved to key role in BV infection, however, the receptor for GP64 on the surface of host cell has not yet been identified.In this study, by using the Pull-down immunoprecipitation,virus overlay protein blot assay and proteomics identification by mass spectrometry, we try to detect and identify this receptor. Furthermore, the structural basis responsible for the interaction between the GP64 and this receptor will be analyzed. The results from this study will provide important clues to understand the interaction between GP64 envelop proteins and receptor, as well as the fusion of viral envelop and cell membrane protein, and finally make clear the viral infection mechanism. Also,it will help us to design more effective chemicals to block the viral infection and give us novel insights on the strategy of pest control.

家蚕核型多角体病毒是一类专一性感染家蚕的DNA病毒，是引起家蚕病害的主要病原。BmNPV在感染周期中会出现两种表型不同但遗传物质完全相同的病毒形态，即出芽病毒BV和包涵体衍生型病毒ODV。ODV通过经口感染寄主，介导昆虫个体间的传播，引发中肠原发感染，而BV负责感染细胞和组织间的水平传播，由此引起寄主的全身性感染。GP64是BV表面的重要特征囊膜蛋白之一，目前已经明确在BV感染过程中起关键作用, 但至今GP64蛋白的受体没有被鉴定。通过免疫共沉淀、病毒覆盖、蛋白质质谱鉴定等技术，鉴定BV GP64感染宿主细胞表面相应受体蛋白，进一步阐明其编码基因和分子特征。本研究的结果将为阐明病毒囊膜蛋白与受体的相互作用，病毒囊膜-细胞膜融合的分子机制等提供科学依据，从而明确病毒粒子进入寄主细胞的分子机理。阐明这些科学问题还将有助于揭示杆状病毒的入侵机制及规律，并为设计抗家蚕病毒入侵的有效药物提供新思路。

家蚕核型多角体病毒既是产业生产上危害最为严重的病原，同时也是研究昆虫病毒学的良好模式。GP64 是家蚕核型多角体病毒BmNPV出芽型病毒粒子BV的一种主要囊膜融合蛋白，在介导BmNPV感染和水平传播过程中发挥关键作用。本研究旨在探究BV入侵宿主的分子机制，鉴定与BV结合的细胞表面蛋白，以及筛选宿主细胞中的GP64互作蛋白，从分子水平阐明杆状病毒BV入侵宿主以及GP64与宿主互作的分子机制。主要结论如下：1、阐明了BV病毒粒子入侵宿主细胞的机制。用抑制剂处理、siRNA干扰和流式细胞实验阐明了BV入侵宿主细胞依赖于内吞泡酸化、网格蛋白和动力蛋白，以及Rab5和Rab7的调控，进一步通过电镜观察BV入侵宿主细胞的早期过程，证明了网格蛋白在此过程中发挥重要功能。2、筛选了与BV结合的宿主表面蛋白。利用病毒覆盖蛋白结合实验，分离并纯化BV病毒粒子以及BmN细胞表面蛋白，利用GP64抗体检测到3个明显蛋白条带，表明细胞表面存在与病毒相互作用的蛋白。进一步通过质谱分析从3个阳性分离胶条中共鉴定到158种蛋白。利用生物信息学技术从中筛选到12个可能与BV结合的宿主细胞膜蛋白受体。3、进一步利用酵母双杂交和CoIP技术鉴定了GP64与宿主的互作蛋白。构建了家蚕BmN细胞酵母文库，以GP64作为诱饵蛋白进行酵母文库杂交分析，共筛选到8个与GP64结合的候选蛋白，分别为E3泛素连接酶SINA-like10、RAN结合蛋白、磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶、卵裂和多腺苷化特异性因子5、Abrupt-like蛋白、NADH泛醌氧化还原酶，以及两个未知蛋白LOC101738779和scaf49 2190774–2191531 (-)。进一步证明了SINAL10与GP64强烈互作且在细胞内共定位。根据病毒覆盖、酵母双杂交和COIP等试验证明Actin,TCTP和SINAL10是GP64的主要受体。