CLE27多肽激素调控拟南芥维管束连续性的机理研究

The formation of vascular bundles is one main feature of higher plants, which distinguishes them from lower plants. During the plant growth and development, vascular bundles are responsible for transport of water, minerals, nutrient and some small signaling molecules. For most axillary organs such as leaf, septal and petal in above-ground organs, the new vascular bundles initiate in these organs and then develop progressively to connect to the vascular bundle network of plants. Therefore, the continuity of vascular bundles is critically important for plants to build up the continuous vascular network. Currently, polar auxin transport has been reported to play key roles in regulating vascular continuity, but other signaling molecules underlying this process are not known. In recent years, it is known that peptide hormones play important roles in regulating cell-to-cell communication. Our previous study showed that in situ overexpression of CLE27 peptide hormone-encoding gene resulted in small petals with discontinuous vascular bundles, and vascular bundles in the basal part of the petal failed to connect to the vascular system in the receptacle. In this project, we will further study the underlying mechanism of CLE27 peptide hormone regulating vascular bundle continuity. Using the CRISPR-Cas9 technology and the antagonistic peptide technology developed by ourselves to further confirm the function of CLE27 peptide hormone in regulating vascular bundle continuity. To identify the possible receptors for CLE27 peptide hormone through screening LRR-receptor kinase mutant library and confirm the direct interaction between CLE27 and the candidate receptors by ITC technology. To elucidate the relationship between CLE27 and factors regulating auxin polar transport and signaling such as PIN1, GNOM, MP et al. Results obtained from these studies will allow us to elucidate the mechanism of CLE27 in regulating vascular bundle continuity.

维管束是高等植物区别于低等植物的重要标志之一，植物地上侧生器官如叶和花器官等的维管束形成均起始于器官自身，随后与其主维管束连接而形成维管束网络。这种维管束的连续性对植物体内维管束网络系统的构建和物质运输具有重要意义。已有研究表明生长素极性运输在植物地上器官维管束连续性形成过程中发挥重要作用，而对其它信号分子了解较少。我们前期工作发现，CLE27多肽激素原位过量表达后，花瓣变小且花瓣基部维管束连续性中断，不能与主维管束连接。本项目将深入研究CLE27多肽激素调控维管束连续性的分子机理。利用基因敲除及拮抗多肽技术明确CLE27在维管束发育连续性中的作用；通过筛选LRR类受体激酶突变体库鉴定CLE27受体，并利用ITC等技术验证其与受体间的直接相互作用；利用突变体和分子标记等分析CLE27与生长素极性运输在控制维管束连续性过程中的关系。通过以上研究阐明CLE27调控维管束发育连续性的分子机理。

维管束是高等植物区别于低等植物的重要标志之一，植物地上侧生器官如叶和花器官等的维管束形成均起始于器官自身，随后与主维管束连接而形成维管束网络。维管束的这种连续性对植物体内物质运输具有重要意义。已有研究表明，生长素极性运输在植物地上器官维管束连续性形成过程中发挥重要作用，而对其它信号分子了解较少。本项目中，我们发现CLE27C6T转基因植物花瓣变小，小花瓣基部维管束缺失，不能与花托主维管束连接。利用维管束不同组织的分子标记分析发现，小花瓣基部没有木质部、韧皮部和原形成层的发生，说明小花瓣基部没有起始维管束发育。鉴于生长素极性运输在维管束连续发育过程中发挥重要作用，我们检测了DR5-GFP在CLE27C6T植物小花瓣基部的分布及PIN1-GFP的定位。共聚焦显微镜观察发现，DR5-GFP信号在野生型植物花瓣基部集中在维管束，而在CLE27C6T植物小花瓣基部呈弥散分布，且在与花托连接处中断。随后我们发现PIN1-GFP在野生型植物中极性定位于原形成层底部细胞膜，而在CLE27C6T植物小花瓣基部，这种极性膜定位消失，主要定位于细胞内部。因此，我们推测CLE27可能通过调控PIN1的极性膜定位及生长素极性运输，进而调控维管束的起始和连续发育。由于CLE家族基因高度冗余，我们创制了包括cle27缺失在内的多组多突变体，但均无可见表型。在创制多突变体过程中，我们建立了一个创制多突变体的简便且省时省力的CASE工具包，极大简化了基因编辑载体构建过程，更主要的是极大方便了后期筛选不携带CRISPR构建的多基因编辑植物。鉴于创制的多组多突变体均无可见表型，为更好筛选与CLE27功能冗余的其他CLE，我们又利用启动子和终止子驱动核定位的3XGFP并转化野生型植物，对CLE家族32个基因在细胞水平的表达模式进行了系统分析。由于3XGFP信号较强，我们发现了很多之前没有报道过的表达模式，鉴定出8个与CLE27具有类似花瓣表达模式的CLE，同时也筛选出在维管束不同组织特异表达的多组CLE，为研究高度冗余的CLE家族基因在维管束发育中的功能奠定了很好的基础。