膀胱ICC钙激活钾/氯通道在糖尿病膀胱功能障碍发生中的作用机制研究

糖尿病膀胱功能障碍（DBD）是一种常见糖尿病并发症，膀胱的神经损害是目前公认的主要病因，但针对神经受体的临床治疗效果并不满意，提示存在有神经损害以外的其他致病机制。我科前期系列研究证实膀胱Cajal间质细胞（ICC）是膀胱兴奋起源、调控和传导的枢纽，并初步证实钙激活钾/氯通道是影响ICC兴奋性的重要环节；同时发现DBD膀胱ICC钙激活钾/氯通道表达异常，推测其导致的ICC兴奋性异常参与了DBD的发生，但机制不清。本课题拟进一步对比研究DBD和正常膀胱ICC钙激活钾/氯通道的表达，并通过体外模拟高糖环境，了解其在培养的正常膀胱ICC的表达变化，明确其在DBD中表达异常的原因；通过观察钙激活钾通道亚型阻滞剂以及增强钙激活氯通道表达后，DBD膀胱ICC细胞兴奋性的变化情况，阐明膀胱ICC钙激活钾/氯通道在DBD发生中的作用机制，结果有助于进一步阐明DBD的发生机理，并为临床治疗提供新的可能靶点。

本研究经STZ诱导构建糖尿病膀胱功能障碍模型，经膀胱及逼尿肌的兴奋性和收缩性等指标鉴定，发现本研究构建的糖尿病膀胱功能障碍模型出现膀胱功能障碍，表现为膀胱及逼尿肌的兴奋性、收缩性减弱，甚至消失，说明模型构建成功。.首先，ICCs细胞特异性表达C-Kit蛋白，因此本实验通过通过磁珠分选获得ICCs，利用PE-C-Kit抗体流式检测上述方法培养的ICCs纯度，结果表明通过磁珠分选获得的细胞纯度在96%，纯度较高，可以满足后续实验的需要。本研究通过免疫荧光和RT-PCR技术对比检测正常及DBD膀胱ICC细胞中各KCa/ClCa通道亚型（BKCa、SKCa2、SKCa3、ClCa）的表达情况发现：与正常组相比，糖尿病ICCs中BKCa、SKCa2、SKCa3表达量均明显升高，而 ClCa表达量明显降低。细胞兴奋性实验表明：糖尿病组ICCs兴奋性指标Ih内向电流明显低于正常组ICCs，在正常ICCs中阻断BKCa、SKCa2、SKCa2蛋白活性可以明显提的ICCs兴奋性，而阻断ClCa蛋白则使ICCs兴奋性降低。.随后本研究通过体外实验研究糖尿病膀胱功能障碍的原因，检测不同葡萄糖浓度对正常膀胱ICC细胞的KCa/ClCa通道各亚型表达及ICCs兴奋性的影响。不同浓度梯度高糖环境下体外培养分离后的正常膀胱ICC细胞，采用免疫荧光双标和RT-PCR技术与正常对照组和无糖组对比检测KCa/ClCa通道亚型的表达及差异变化。结果表明：随着葡萄糖浓度的提高，BKCa、SKCa2、SKCa2的表达量呈现逐渐增加的趋势，ClCa的表达量则呈现不断降低的趋势；在高糖浓度下，ICCs兴奋性指标Ih内向电流明显降低，而阻断BKCa、SKCa2、SKCa2蛋白活性可以明显恢复高糖浓度下的ICCs兴奋性，而阻断ClCa蛋白则高糖浓度下的ICCs兴奋性进一步降低。.最后，通过增加DBD膀胱ICC细胞KCa/ClCa通道表达，以及结合KCa通道亚型阻滞剂对ICC细胞兴奋性的影响研究。发现阻断BKCa、SKCa2、SKCa2蛋白活性的同时过表达ClCa蛋白较阻断BKCa、SKCa2、SKCa2蛋白活性组相比可以明显提高ICCs兴奋性。.综上所述，BKCa、SKCa2、SKCa2蛋白在DBD中的表达上升和ClCa蛋白的表达下降可能是糖尿病膀胱功能障碍的重要影响因素。