基于microRNAs研究汉黄芩素联合转染p53基因诱导肺癌细胞凋亡的分子机制

Wogonin can induce apoptosis in lung cancer cells and its co-transfection of exogenous wild p53 gene has a more significant effect. Causing the expression increase of p53 gene may be related to the mechanism. MiRNAs involve in the regulatory networks of p53 gene, especially，miR-34s and p53 gene can form the positive feedback adjusting network to regulate cell apoptosis induced by p53 gene. To clarify the molecular mechanism of lung cancer cells' apoptosis induced by wogonin co-transfection of exogenous wild p53 gene,the research attempts to import exogenous wild p53 gene into lung cancer cells A549, H1299 and 95D which varies in endogenous p53 status and observe changes of lung cancer cells' form, cycle and apoptosis after wogonin processing. The study will apply methods of microRNA chips, proteomics and naked mouse animal model to observe expression profiling changes of lung cancer cell miRNAs as well as expression changes of related protein. It will also use method of bioinformatics to predict key miRNAs molecules and validate by anti-miRNA oligonucleotides, thereby, to clarify whether miR-34s or other miRNAs play an important role in signal transduction by affecting the expression of downstream proteins, to provide method reference and theory basis for improving lung cancer treatment result and antitumor mechanism research using traditional Chinese medicine.

汉黄芩素能诱导肺癌细胞凋亡，联合转染外源性野生型p53基因作用更加显著，机制可能与上调p53基因表达有关。miRNAs参与p53基因调控网络，尤其是miR-34s与p53基因形成正反馈调节网络，调控p53基因诱导的细胞凋亡。为明确汉黄芩素联合转染外源性野生型p53基因诱导肺癌细胞凋亡的分子机制，本研究拟将外源性野生型p53基因导入内源性p53基因状态不同的肺癌A549、H1299和95D细胞，以汉黄芩素进行处理，观察肺癌细胞形态、周期和凋亡的变化，采用microRNA芯片、蛋白质组学和裸鼠动物模型方法观察肺癌细胞miRNAs表达谱以及相关蛋白质的表达变化，生物信息学方法预测关键miRNAs分子，以抗miRNA寡核苷酸进行验证，明确是否miR-34s或其他miRNAs通过影响下游蛋白质的表达发挥重要的信号转导功能，从而为中药抗肿瘤机制研究和提高肺癌的治疗效果提供方法参考和理论依据。

研究背景：.肺癌是导致人类致命的恶性疾病之一，每年导致数百万人死亡。它通常起源于呼吸道上皮细胞，然后通过恶性转移扩散到邻近组织或器官，最终扩散到全身各处。肺癌主要分为两大类，小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC），其中非小细胞肺癌约占所有肺癌患者数量的85%。非小细胞肺癌可进一步划分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。目前对于肺癌的治疗策略，通常是手术以及化疗；患者生存期和存活率与恶性程度以及癌症分期有关。铂类药物，例如顺铂和碳铂，是目前肺癌化疗的一线用药。但是，使用此类药物会有多种不良反应，包括但不限于心肌毒性、肠道损伤和外周神经病等。因此，探索新的疗法对延长患者生命、提高生活品质至关重要。.汉黄芩素（wogonin），是从唇形科多年生草本植物黄芩、半枝莲以及夹竹桃科植物鳝藤等植物中分离得到的一种重要的黄酮类化合物，化学名称是5,7-二羟基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮，分子式为C16H12O5。目前多项研究表明，汉黄芩素具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、神经保护、抗肿瘤和抗病毒等，特别是抗肿瘤活性，目前是国内外研究的一个热点。.我团队根据现有文献报道，进行了一些前期研究，结果显示，汉黄芩素对肺癌A549、H1299和95D细胞均具有不同程度的生长抑制作用。汉黄芩素抗肿瘤作用的机制目前尚未阐明。.主要研究内容与重要结果：.一、使用PLGA材料，制成可生物降解的纳米颗粒，并且使用齐墩果酸（oleanolic acid， OA）对纳米颗粒进行修饰，制成纳米药物。然后使用纳米药物，进行体外实验，与游离状态的汉黄芩素抗肿瘤效果相比较。并且研究纳米药物对肿瘤细胞凋亡相关信号通路的影响。.二、在小鼠肿瘤模型中，使用PEG修饰的纳米药物（PEG-NP）、没有PEG修饰的纳米药物（OA-wogonin-NP），以及汉黄芩素单体药物，分别注射到小鼠体内，考察不同形式的汉黄芩素的药代动力学特征，并考察药物在体内各器官的分布情况。.三、研究了纳米药物对著名抗肿瘤基因p53信号通路的影响。研究结果显示，wogonin对p53基因功能缺失的非小细胞肺癌细胞系毒性最大。考虑到作为抑癌基因的p53经常在肿瘤中功能缺失，汉黄芩素作为抗癌药物的开发具有很大的潜力。