地克珠利对球虫蛋白激酶C受体的影响及机制研究

目前，人们对地克珠利抗球虫的分子机制仍知之甚少，这不仅妨碍了药物的安全使用，也不利于新药开发。激活蛋白激酶C受体(RACK)几乎在所有生物类型中普遍存在，并对寄生虫发育和入侵起着重要作用，但在球虫体内一直未有报道。本课题组在前期研究工作中采用抑制消减杂交技术和cDNA芯片技术，在国内外首次筛选并证明地克珠利作用后柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中存在RACK基因差异表达，但目前仍未弄清地克珠利对RACK的影响和作用机制。因此，本项目将结合体内外试验建立地克珠利抗球虫作用模型，采用real time-PCR、Westen-blot、免疫共沉淀等分子生物学技术分别检测地克珠利对RACK mRNA表达量、蛋白表达量和磷酸化水平的影响，研究地克珠利对RACK的调控作用，弄清其在切断球虫生活史中扮演的角色。这对进一步了解该受体的生理功能，对阐明地可珠利抗球虫分子机制和筛选新的抗球虫分子靶标都具有重要意义。

本研究首次展开球虫RACK蛋白研究，旨在通过研究三嗪类化合物地克珠利与RACK之间的关系，了解地克珠利对RACK的调控作用以及在切断球虫生活史中扮演的角色，从而进一步了解RACK在球虫体内的重要生理学功能。项目实施期间，利用5′race和3′race技术，我们从球虫基因组克隆到了RACK全长序列。测序结果表明，柔嫩艾美耳球虫RACK基因全长1264bp,包含一个957bp编码框，编码318个氨基酸。进一步分析，柔嫩艾美耳球虫RACK蛋白拥有7个WD40功能域。同源比较分析结果表明，柔嫩艾美耳球虫RACK蛋白与刚体弓形虫RACK蛋白（GenBank编号：XP_002370996.1）同源率高达 98%。利用大肠杆菌原核表达体系，我们对柔嫩艾美耳球虫RACK蛋白进行原核体外表达，优化了表达条件，使柔嫩艾美耳球虫RACK蛋白在体外得到高效可溶性表达，从而得到特异性较高的柔嫩艾美耳球虫RACK蛋白抗体。借助QRT-PCR技术，我们分析了地克珠利作用球虫后，RACK mRNA水平的变化。实验结果表明：相对对照组，地克珠利作用后，RACK mRNA表达水平下降了81.3 %。蛋白表达水平上，相对对照组，地克珠利处理组几乎无法检测到RACK蛋白。另一方面，采用免疫组化方法，我们检测了柔嫩艾美耳球虫RACK蛋白亚细胞定位，可以观察到：在柔嫩艾美耳球虫入侵过程中，RACK蛋白集中、大量地表达于球虫顶部；经过地克珠利处理后，球虫顶部检测不到RACK蛋白。这一系列实验结果，较好地解决了我们项目计划书提出的科学问题，即确定地克珠利对柔嫩艾美耳球虫RACK的影响及作用机制。探索RACK在球虫生命中可能存在的生理学作用；更清晰地描述了地克珠利抗球虫机制，也为新型抗球虫药物的研制提供了新的药物靶标。. 项目执行三年来，发表SCI文章四篇，影响因子均为2分以上，培养硕士研究生两名，其中一名获得中国农业科学院优秀硕士论文奖励。