RNAi阻断乙型肝炎病毒在人胎盘滋养细胞中复制的作用

RNA 干扰（RNAi）是动、植物抵抗外来病毒感染、抑制病毒复制的一种重要细胞内保护机制，作为抗HBV感染新疗法的研究近年来取得一定成果，但尚未有 RNAi 应用于HBV 母婴传播阻断的报导。既往研究表明，以滋养细胞为主的胎盘细胞感染是HBV宫内传播的主要途径，本项目以原代培养的滋养细胞和滋养细胞来源的细胞系为研究对象，构建HBV重组真核表达质粒转染细胞，以获得稳定表达HBV相关核酸及蛋白质的感染模型；设计构建针对S mRNA / C mRNA 的siRNA 表达盒对感染模型进行干预，荧光定量PCR、RT-PCR检测模型中 HBV DNA及RNA水平，ELISA、免疫荧光标记、激光共聚焦检测HBsAg、HBeAg、HBcAg表达，透射电镜观察胞内病毒颗粒含量，从DNA、mRNA、蛋白质三个水平及形态学层面对干预效果进行综合评价，探讨RNAi在阻断HBV宫内传播方面的可行性。

项目完成情况及取得的成果：.1) 在分离的乙肝胎盘滋养细胞中可检测到低水平的cccDNA表达，提示胎盘中存在HBV 的复制但复制水平不高；以滋养细胞来源的细胞系（JEG-3 和 JAR 细胞）作为研究对象，以3倍 HBV 基因组重组质粒转染细胞。可检测到 HBV 各种形式的病毒 DNA 表达、以及多种病毒抗原的表达，从DNA、RNA、蛋白质三个层面说明细胞模型中存在 HBV 的复制，获得表达 HBV 相关核酸及蛋白质的滋养细胞感染模型，具备进行 RNA 干扰的基础。设计构建 4 种针对 HBV SmRNA 的 shRNA 表达载体，分别为pS-603、pS-475 、pS-66、pS294，4种shRN表达质粒中，pS-603、pS-475 、pS-66 干扰效果明显，而 pS-294 干扰效果不明显。RNA 干扰可抑制 HBV 感染滋养细胞体外模型中病毒蛋白的表达。（见成果1：王冬菊博士学位论文）.2) HBV感染使JAR细胞膜的表面形态发生改变，可能与HBV破坏细胞膜上的颗粒有关；较高浓度的HBIG有保护JAR细胞抵抗HBV感染的作用。孕晚期用用乙肝免疫球蛋白未发现导致HBV病毒S区基因变异，病毒基因型与HBV宫内感染发生率无显著相关性。（见成果2、3、4、5）.3) HBV感染可影响胎儿-胎盘的生长发育，导致胎盘体积缩小，出生体重降低。胎盘体积是HBV宫内感染的保护因素，新生儿HBsAb阳性者的胎盘体积大于新生儿HBsAb阴性者孕次和胎盘HBsAg阳性是胎盘HBV cccDNA阳性的危险因素。随着母血HBV DNA滴度的升高，胎盘HBV cccDNA滴度增加，微血管体积密度增大。胎盘HBV感染者，胎盘滋养细胞和绒毛间质细胞的凋亡指数增高。（见成果6、7）.4) HBsAg携带孕妇胎盘组织TLR3、TLR7表达显著高于正常非HBsAg携带孕妇，胎盘TLR3、TLR7可能参与HBV垂直传播的免疫调控；胎盘TLR4的表达在HBsAg携带孕妇与正常孕妇间无显著性差异；HBsAg携带孕妇胎盘TLR3的高表达与新生儿HBsAb密切相关，胎盘TLR3可能参与新生儿抗HBV的免疫调节。（见成果8、9、10）.5) 改良的密度梯度离心法联合反复贴壁法分离胎盘滋养细胞，可获得较大量、纯度满意的滋养细胞，而且操作简单，便于在一般实验室中推广应用。（见成果11）