胆盐膜受体TGR5在移植肝胆管纤维化中的作用与机制研究

移植物胆管病（GS）是严重影响肝移植受者长期生存的难治性疾病。局灶性或弥漫性的胆管树纤维化是GS发病的关键步骤。疏水性胆盐（HBS）是最重要的内源性移植肝胆管纤维化诱导因子。结合我们前期实验的结果及最新研究进展，我们提出：新近发现的胆盐膜受体TGR5可能介导了HBS对移植肝胆管树的促纤维化作用，而TGR5-JNK-ETS1 -αvβ6-TGFβ1可能是其主要信号通路之一。本课题是我们前期工作的继续和深入。我们拟分别以转基因小鼠肝移植模型和模拟冷保存/再灌注条件下的胆管上皮细胞为实验对象，使用分子克隆与杂交、RNA干扰、免疫荧光、激光共聚焦技术等方法，通过体内、外实验系统研究TGR5在HBS诱导移植肝胆管树纤维化中的作用，并初步探讨TGR5可能的下游信号通路。本课题的研究将为人们深入认识GS的发病机制，从而设计具有更高效能及特异性的GS预防和治疗策略提供新的思路。

胆管病（cholangiopathy）本质上是胆管树在遭受损伤后异常修复的结果。在这一过程中，局灶性或弥漫性的胆管树纤维化是其关键步骤，也是胆管树狭窄、扩张、毁损及管型/结石形成的病理基础。作为胆汁主要成分之一的疏水性胆盐（hydrophobic bile salts, HBS）具有很强的细胞毒性，也是已知效能最强的内源性促胆管纤维化因子，在移植肝胆管纤维化中扮演着重要角色。通过本课题，我们发现小鼠肝移植术后移植肝胆管上皮细胞（BEC）整合素αvβ6的表达显著上调，并且与胆管纤维化分期高度相关。特异性抑制整合素αvβ6可以明显下调移植肝TGFβ1的表达，缓解胆管纤维化并改善肝功能。进一步研究发现，小鼠肝移植术后胆盐膜受体TGR5的表达亦上调，并且与胆汁胆盐输出量相关。特异性抑制TGR5后，整合素αvβ6表达的上调幅度较阻断前显著降低，内源性TGFβ1的活化也受到一定程度的抑制，同时纤维化相关基因如TGFβ2、procollagen α1、α-SMA的表达也有不同程度的下调。提示TGR5与整合素αvβ6-TGFβ轴之间存在密切的相互作用，而TGR5-αvβ6-TGFβ1这一途径可能是HBS诱导胆管纤维化的主要途径之一。体外实验显示，在模拟缺血、缺氧环境下，经过脱氧胆酸（DCA）刺激的人及小鼠BEC的TGR5、αvβ6和TGFβ1的表达均显著上调，分别采用RNAi技术阻断TGR5和αvβ6后，TGFβ1等纤维化相关基因的表达变化与体内实验的结果一致。需要指出的是，我们发现经DCA刺激的BEC其α-SMA和S100A4等间叶标志物的表达均上调，同时细胞出现部分间叶细胞的特征，提示BEC有可能通过上皮-间叶样表型转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）这一过程转变为成纤维细胞（myofibroblast, MFB）以促进胆管纤维化。本研究发现了TGR5-αvβ6-TGFβ1这一通路在移植肝胆管纤维化中的重要作用，加深了我们对于移植物胆管病发病机制的认识，对发展新的胆管病防治手段具有重要的临床价值。