不同NO供体对AKT1的特异性亚硝基化修饰及其机理研究

As a central hub of multiple important signaling pathways, AKT1 is functionally involved in normal cellular physiology process by selectively phosphorylating downstream substrates. Constitutive activation of AKT 1results in pathway aberrations, leading to diseases like diabetes and cancer. S-nitrosation of AKT1 regulates enzyme function and thus signal transduction. Previous research have shown that different cysteines on AKT are specifically S-nitrosated in terms of different NO donors, showing that sensitivity of cysteine S-nitrosation is NO donor-dependent. By applying a competitive cysteine-reactivity profiling strategy on human breast cancer cell lysate, we aim to: (1) establish which cysteine residue on AKT1 is most sensitive to a given NO donor before in vitro and in vivo confirmation of the specificity between cysteine residue and corresponding NO donor; (2) investigate the functional relevance of these S-nitrosation-sensitive cysteines on AKT1, such as enzymatic activity, active site phosphorylation and cellular translocation; (3) computationally evaluate possible factors that could dictate cysteine sensitivity/NO donor specificity to S-nitrosation, e.g. amino acid properties, protein primary and tertiary structure and sequence motif, chemical structure of NO donors, and binding interaction process between NO donor and specific cysteine thiol. These studies are key to elucidating the mechanism of S-nitrosation regulation on AKT1, and may shed light on the AKT1 isoform-targeted drug development.

作为处于细胞内多个信号通路中心环节的关键蛋白，AKT1广泛参与并调节细胞生命活动。其过活化引起的信号通路失调与糖尿病和癌症等密切相关。亚硝基化修饰影响AKT1的功能和信号通路传导，是其重要的生物学基础研究问题和蛋白质组学难点。前期研究发现不同NO供体特异性亚硝基化AKT1上不同Cys，体现出Cys对NO供体敏感性的差异。本课题拟在此基础上：（1）利用竞争性蛋白质组学方法，在人乳腺癌细胞中筛选对不同NO供体高敏感的AKT1 Cys；（2）研究高敏感Cys亚硝基化对AKT1酶功能、活性位点磷酸化和蛋白在胞内定位的调节，在机理上探索亚硝基化对AKT1活性的影响规律；（3）分析蛋白一级序列、三级结构、氨基酸理化性质、NO供体化学结构及其与Cys结合过程，探索Cys被NO供体特异性修饰的决定因素，以期对蛋白质亚硝基化的调控机制和功能实质的阐明奠定重要理论依据，对开发AKT1靶向药物提供线索和思路。

本项目拟研究不同NO供体如何通过特异性半胱氨酸Cys S-亚硝基化S-nitrosation修饰，影响AKT1这一重要激酶在乳腺癌细胞里的功能或定位等，并探究决定不同NO供体特异性亚硝基化AKT1不同Cys位点的普遍因素，有望对开发AKT1靶向药物提供线索和思路。该项目证明了蛋白质Cys对特异性探针的反应活性和对亚硝基化敏感性并无直接联系，排除了Cys反应活性对其亚硝基化程度的影响。在哺乳动物细胞里成功过表达AKT1 WT和C310S蛋白，并验证了Cys310对AKT1磷酸化底物GSK的激酶功能有重要作用。不同NO供体亚硝基化AKT1的系列蛋白质组学实验表明：(1).GSNO可以亚硝基化Cys60、Cys77和Cys310位点。Cys310对GSNO高敏感，Cys60和Cys77的亚硝基化程度取决于两者是否形成二硫键，且Cys77依赖程度更大。和还原态对比，当Cys60和Cys77形成二硫键时，两者的亚硝基化敏感性大幅度降低。(2). TrxNO亚硝基化Cys310和Cys77，且Cys310敏感性远高Cys77。(3). Cys310显示对CoA-SNO高敏感，且不会因为AKT1和配体ATP的结合而受到影响。 此外，在大肠杆菌中成功表达并在体外纯化得到大量模型蛋白GAPDH，其Cys152可被实验室制备的新鲜GSNO亚硝基化，但部分产物即刻被GSNO中的杂质GSH还原为Cys，因此后续实验中将使用购买的GSNO作为亚硝基化试剂。以上实验结果肯定了Cys亚硝基化对AKT1功能有重要影响，并且AKT1不同位点Cys对不同NO供体敏感性均有不同，为进一步重点研究亚硝基化对AKT1活性调节，和AKT1亚硝基化特异性的决定因素的探索，提供了可靠的研究基础，以及成熟的实验模型和实验条件。