蛋白质亚硝基化对猪肉持水力的作用机理研究

High drip loss or PSE meat resulted from low water holding capacity (WHC) is the key issue affecting consumer acceptance and industry profitability of pork in China. Increased reactive oxygen and nitrogen species could accumulate in pork muscles during postmortem aging. Nitrogen species, including nitric oxide produced by the catalysis of nitric oxide synthase, could react with sulfydryl of protein cysteine to form protein nitrosylation regulating protein structure and function. Previous results have shown that nitric oxide synthase could be activated in postmortem pork and managing the level of nitric oxide synthase could influence biochemical parameters of pork during postmortem aging. Current proposal focuses on investigating the effects of protein nitrosylation on calcium release from sarcoplasmic reticulum, energy metabolism, µ-calpain proteolytic activity, and myofibrillar protein degradation during postmortem aging of porcine skeletal muscles. Employing immunomics, proteomics and other technologies to qualitatively and quantitatively analyze the effects of protein nitrosylation on protein conformation and function, especially for µ-calpain nitrosylation during postmortem aging, is of great significance to investigate the mechanism of WHC in postmortem pork. Our purpose is to explore the basic mechanism about the effect of protein nitrosylation on pork WHC which will further develop the theory of pork aging and provide knowledge to improve pork quality for pork industry.

目前我国猪肉低持水力造成的滴水损失或PSE肉是影响消费者接受程度和猪肉产业经济效益的难点问题。宰后猪肉成熟期间产生大量的活性氧类及氮类物质，其中由一氧化氮合成酶催化产生的一氧化氮，会修饰蛋白质的半胱氨酸巯基导致蛋白质亚硝基化并调控蛋白质的结构与功能。前期研究结果表明一氧化氮合成酶在宰后猪肉中存在活性，调控其活性可以影响猪肉成熟过程中的生理生化变化。基于前期研究，本项目重点研究蛋白质亚硝基化对猪肉成熟过程中钙离子释放、能量代谢、钙蛋白酶1活性及肌原纤维蛋白降解的影响，使用免疫组学、蛋白质组学等技术，探讨猪肉成熟过程中关键结构蛋白质和钙蛋白酶1的亚硝基化及对其结构与功能的影响机制，阐明蛋白质亚硝基化与猪肉持水力的关系。本项目研究蛋白质亚硝基化对宰后猪肉成熟过程中持水力的影响机制，深入阐述猪肉成熟过程中肌细胞的生理生化变化，丰富和发展宰后猪肉的成熟理论，为提升我国猪肉品质提供理论依据。

由低持水力导致的异质猪肉是制约我国猪肉工业发展的难点问题。一氧化氮合成酶（Nitric oxide synthase, NOS）催化产生的一氧化氮（Nitric oxide, NO）会修饰蛋白质的半胱氨酸巯基，导致蛋白质亚硝基化并调控蛋白质的结构与功能，但是关于蛋白质亚硝基化对猪肉成熟过程中品质特别是持水力的影响研究，目前国内外还未见报道。因此，本项目旨在研究蛋白质亚硝基化对猪肉成熟过程中肌肉细胞能量代谢、钙离子稳态和肌原纤维蛋白降解的影响，从而阐明蛋白质亚硝基化对宰后猪肉成熟过程中持水力的作用机理。主要创新性结果如下：. 1. 通过NOS抑制剂和NO供体对猪背最长肌进行处理发现，NOS抑制剂处理能够加速宰后猪肉糖酵解过程，增加猪肉的滴水损失和贮藏损失，降低猪肉持水力。糖酵解关键酶亚硝基化程度的鉴定结果发现，不同处理组关键能量代谢酶亚硝基化可显著抑制其活性，因此蛋白质亚硝基化修饰能量代谢酶是其调控猪肉能量代谢的重要途径。. 2. 宰后1小时正常肉和PSE（颜色苍白，肉质柔软，渗水率高）肉猪背最长肌的NOS的活性及nNOS的含量差异显著。与正常肉相比，PSE肉肌浆钙离子浓度显著提高，钙离子释放通道（RyR1）和肌浆网钙离子ATP酶1（SERCA1）的表达量降低和亚硝基化程度升高，而 SERCA1的活性降低。钙离子释放通道和SERCA1的亚硝基化修饰可能是调控肌肉钙离子稳态的主要机制。. 3. NO可在钙蛋白酶抑制蛋白存在条件下进一步修饰μ-钙蛋白酶，提高其亚硝基化强度和引起其氧化还原态的变化，抑制μ-钙蛋白酶的活性、自溶和降解肌原纤维蛋白的能力，NO可改变肌原纤维的氧化还原状态并影响其被μ-钙蛋白酶降解的程度，进而调控猪肉的品质。. 本项目研究结果表明宰后猪肉成熟过程中NO介导能量代谢酶、SERCA1、RyR1及钙蛋白酶发生亚硝基化修饰，影响宰后猪肉能量代谢、钙离子释放、μ-钙蛋白酶自溶及其他关键结构蛋白降解等重要的生理生化过程，进而调控宰后猪肉成熟过程中的持水力。