快速、长时程多角度三维海森结构光照明显微镜

High-speed three-dimensional Super Resolution (SR) microscopy provides a powerful tool to observe the three dimensional dynamic activity in living cells, which is significant for biology research. Most of the current SR imaging system can only be adapted for fixed sample, nevertheless, the Hessian Structured Illumination Microscopy (Hessian-SIM) we developed before can be used to the live cell imaging at a two-dimensional level. However, an appropriate three-dimensional SR microscopy, which can be used to observe the rapidly volume dynamics in living cells, is still desired. Based on our two-dimensional Hessian-SIM, we will further improve the hardware and algorithms to develop the Multi Angle Total Internal Reflection Fluorescence Hessian Structured Illumination Microscopy (MA-TIRF-Hessian-SIM) with 90 nm lateral resolution, 50 nm axial resolution, and 10 Hz temporal resolution near the cell membrane. The MA-TIRF-Hessian-SIM can be applied for imaging the volume structures and activities in living cells, which will fill in gaps in three-dimensional SR imaging in living cells.

高速三维超分辨显微镜，可以用于观察活细胞三维动态活动，对于生物学研究非常重要。目前的超高分辨率显微镜大部分都是用于固定的样本成像，我们之前发展的快速、长时程海森结构光照明显微镜可以很好地用于活细胞研究，但是还是限制在二维平面上，目前还不存在可以在活细胞中研究快速变化的三维生命过程的超分辨率显微镜。在我们之前所发展的二维超高分辨率结构光显微镜的基础上，我们希望进一步完善其硬件、算法和控制系统，发展出快速、长时程多角度三维海森结构光照明显微镜，在细胞膜表面500 nm的三维空间内，实现横向分辨率90 nm，轴向分辨率50 nm，时间分辨率达到10 Hz的三维超分辨率成像。弥补活细胞三维超分辨率成像的空白，真正用于监测活细胞内三维精细的生命活动。

荧光显微成像是分子生物学研究的主要手段，但荧光成像有两大限制：一是较宽的荧光发射光谱限制了多色成像能力，缺乏对细胞内结构的整体成像；二是光毒性影响活细胞的状态。为解决上述问题，申请人联合北京大学物理学院施可彬课题组的董大山和北京大学陈良怡课题组李柳菊发明了超分辨荧光辅助衍射层析（SR-FACT）双模态显微成像技术。其中的无标记模态为光学衍射层析成像（Optical Diffraction Tomography, ODT），具有优异的分辨能力，且无光毒性的限制，因而可以长时间、全面地记录细胞内各种细胞器间的三维相互作用动态；结合海森结构光照明超分辨率荧光显微镜，能同时对细胞进行分子特性的荧光超分辨率成像和折射率分布的全景成像。 .目前，如何在活细胞中以高的时空分辨率可视化囊泡分泌及耦联事件仍面临一系列挑战,其中一个关键的技术瓶颈是缺少合适的可视化荧光蛋白探针。广泛用于囊泡分泌研究的绿色pH敏感荧光蛋白在完整的囊泡内部时荧光强度很弱，无法同时监测囊泡锚定及分泌过程。可指示囊泡分泌的红色pH敏感荧光蛋白的缺席限制了利用双色成像来研究囊泡分泌与其他相关生物学事件关系的能力。因此申请人联合中科院生物物理所徐平勇团队刘安远（负责蛋白进化）发展了pH敏感的红色荧光蛋白探针pHmSarlet，pH从5.5到7.5，其荧光强度增加26倍，并且在pH 7.4的条件下，其pKa接近最优值（pKa = 7.2）。.申请人还与北京大学吴聪颖课题组合作，应用海森结构光照明显微镜研究肌动蛋白Myo19在线粒体上的定位及功能。由于海森结构光照明显微镜超灵敏的特点，在看清楚线粒体内嵴的同时，还可以在Myo19-EGFP-knock in细胞系上超分辨率的观测Myo19定位在线粒体的嵴连接（Cristae junctions）处。并且发现Myo19-EGFP信号显示出近似线粒体内嵴信号的同步运动，两者具有高度的时空相关性，进一步证实了Myo19所提供的力学效应调控了线粒体内嵴结构的形成。.上述相关研究结果对超分辨荧光成像、无标记双模态成像、胰岛素分泌和线粒体内嵴形态的维持的进一步研究提供了有力的技术支撑和创新策略，对生物学及医学研究将发挥重要作用。