EBV诱发淋巴瘤的病毒致瘤基因筛选和功能研究

在我们已成功构建hu-PBL/SCID嵌合体小鼠并证实EB病毒诱发人源B细胞淋巴瘤的基础上，本课题采用EBV基因芯片、实时荧光定量PCR技术相结合，检测比较"正常人"淋巴细胞、体外EBV 转化淋巴母细胞与SCID小鼠体内EBV诱发淋巴瘤细胞中EB病毒全基因组的转录表达谱，筛选EBV诱导人淋巴细胞转化和淋巴瘤发生的候选致瘤基因。然后验证并检测分析这些EBV候选致瘤基因在多例"正常人"淋巴细胞、体外EBV转化淋巴母细胞和体内EBV诱发淋巴瘤细胞中的DNA甲基化状态和转录表达水平，揭示EBV诱发淋巴瘤的基因表达模式。再分别采用基因转染、RNA干扰实验等方法，进一步研究EBV候选致瘤基因的功能和作用。这对于深入了解EB病毒基因组的功能，以及阐明EBV诱发淋巴瘤的分子机制具有重要意义。

通过本项目研究，我们创建了体外EB病毒（EBV）转化淋巴母细胞和SCID小鼠体内EBV诱发淋巴瘤动物模型的实验模型。通过构建hu-PBL/SCID嵌合体小鼠，采用EBV诱发产生人源B细胞性淋巴瘤，从而证实了EB病毒对人正常细胞的致瘤性。我们检测诱发瘤细胞中EB病毒基因BZLF1、EBER表达阳性；连续监测小鼠血清中人IgG的含量，显示IgG水平在诱发淋巴瘤小鼠血清中升高。. 采用实时定量PCR和Western bolt方法检测发现EBV转化淋巴母细胞和诱发淋巴瘤细胞中EB病毒潜伏膜蛋白（LMP-1、LMP-2A、LMP-2B）基因表达均显著上调，提示LMPs基因在诱导淋巴细胞转化和淋巴瘤发生中发挥了重要作用。采用实时定量PCR和Western blot技术，分别检测“正常人淋巴细胞”、EBV转化淋巴母细胞和诱发淋巴瘤中EB病毒六种核蛋白(EBNAs)的基因表达情况，结果显示，EBNA-1、EBNA-3A在转化淋巴母细胞和诱发淋巴瘤细胞中均表达上调；EBNA-2、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP在“正常人”淋巴细胞不表达，在转化细胞和诱发淋巴瘤细胞中表达阳性。. 采用Agilent全基因组表达谱芯片检测并分析正常人淋巴细胞及其配对的体外EBV转化淋巴母细胞的差异表达基因，共筛选出1745个差异表达基因，其中上调基因917个，下调基因828个。构建出EBV诱导人淋巴细胞转化的基因功能关系网络，分析发现E2F1, PLK1, PTPN11, BIRC5, FYN等是EBV诱导淋巴细胞发生转化的关键分子，其中E2F1可能在细胞周期调控中具有中心作用。. 通过细胞实验观察转染PLK1基因后诱导细胞生长增殖和恶性演进情况。建立稳定表达ebv-miR-BART16的淋巴瘤细胞系，利用RNA干扰实验等观察ebv-miR-BART16对凋亡信号通路相关基因的靶向调节作用，研究EB病毒miR-BART16调节凋亡信号途径促进淋巴瘤发生的机制。. 我们率先提出EBV诱发瘤的病毒致瘤基因表达及分子病变，获得了EBV诱发淋巴瘤的基因表达谱，探查发现EBV诱导人淋巴细胞恶性转化的某些关键基因。