MAPK通路在AMP诱导的肠上皮细胞凋亡中的作用

我们前期研究和他人实验均表明能够引起小肠上皮细胞（IEC-6）明显凋亡的单一核苷酸为腺苷一磷酸（AMP）。有研究认为AMP以腺苷的形式发挥作用，而在肿瘤细胞中，腺苷可通过激活AMPK诱导凋亡。我们前期研究发现位于AMPK下游的MAPK通路中部分基因的表达受到AMP影响，推测该通路参与了凋亡，但究竟是哪一条MAPK通路参与凋亡，是否与上游AMPK的激活及caspase有关？这些问题尚不清楚。本项目拟在前期基础上，以IEC-6为研究对象，采用Western Blot、Real-time PCR等手段，探讨AMP对AMPK、MAPK通路和caspase的影响，判断影响凋亡的具体MAPK通路和caspase；并从动物水平加以验证，揭示MAPK通路在AMP诱导的细胞凋亡中的作用。通过本项研究成果可以深层次的解释核苷酸对肠道的作用机制，进一步为核苷酸的应用研究提供坚实的理论基础。

本课题主要研究腺苷一磷酸（AMP）调控肠上皮细胞的凋亡是否与MAPK通路中ERK1/2、JNK以及P38通路有关，为此前期研究计划的要点为：1）、体外利用小鼠肠上皮细胞株IEC-6凋亡的影响；2）AMP对IEC-6细胞中ERK1/2、JNK以及P38这三条MAPK通路的影响；3）动物试验探讨MAPK通路在细胞凋亡中的作用。.经过三年研究，围绕计划要点展开工作，主要结果如下：.1）采用一定浓度的AMP（0、0.01、0.1、1 mmol/L）处理IEC-6细胞后，细胞的生长受到抑制，且随着AMP浓度的增加，抑制程度越严重，1mmol/L。细胞在加入AMP 48h后出现凋亡，出现DNA Ladder，并且凋亡率随着AMP浓度的增加而升高。由于1 mmol/L AMP对细胞影响较大，因此我们在后续的试验中采用0.1 mmol/L AMP处理细胞。.2）采用0.1 mmol/L AMP处理细胞，在不同的时间收获细胞，提取总蛋白，采用Western Blot检测MAPK通路中ERK1/2、JNK、p38的表达及其磷酸化情况。结果发现在加入AMP后2h，ERK1/2的磷酸化水平开始明显升高，一直持续到24h。总ERK1/2、JNK、p38以及磷酸化的JNK和P38没有明显改变。AMP处理使得活化形式的Caspase 3蛋白增加，但下游的Bax、Bcl-2、P53蛋白的表达没有变化。这表明AMP可以激活ERK1/2 MAPK通路以及下游的Caspase 3。.3）这对上述实验结果，我们采用特异性的ERK1/2抑制剂PD98059抑制ERK1/2通路，观察在该通路受到抑制后AMP对细胞的影响。结果发现加入PD98059预处理IEC-6细胞后，再加入0.1 mmol/L 的AMP，细胞生长情况得到明显改善（P＜0.01）（见Fig. 8.1），PD98059使得ERK1/2磷酸化水平明显下降，AMP处理后p-ERK1/2的表达没有明显变化（见Fig. 8.2）。这说明实验采用PD98059成功的抑制了ERK1/2通路，且抑制ERK1/2通路可以抑制IEC-6细胞的凋亡，AMP可通过激活ERK1/2通路诱导IEC-6细胞凋亡。.4）给Balb/c小鼠灌胃AMP，在实验的第7、14、30天取样，分析AMP对肠道发育的影响。检测结果发现AMP对小鼠的体增重、胸腺指数、脾脏指数、小肠长度及小