基于"失敏"机制构建的具有协同保护作用的靶向双药纳米微球对缺血性再灌注肾损伤的效果评价及机制研究

Renal ischemia reperfusion (I/R) injury lack of effective treatment. Excitatory toxicity play an important role in I/R. Recent studies show that blocking NMDAR(excitatory amino acid receptor) and its downstream dead signal path will be a efficient therapy. Previous study in our lab showed that reactive oxygen species(ROS) induced by I/R could increase the cellular death sensibility to Ca2+ and counteract the protective effect of NMDAR blocker.Therefore, we propose that co-delivery of NMDAR blocker(D-AP-5) and antioxidant could generate synergistic protective effect. The current research tries to evalute the synergistic protective effects in vitro and in vivo， and elucidate the possible mechanism. Otherwise, short half-time and low concentration in the kidney are important factors of reno-protective drugs' poor effects. Recent study reported the macromolecular high permeability and retention phenomenon in I/R kidney. Through delivering resveratrol and D-AP-5 by co-loaded nanoparticles, we could protect kidney from IRI effectively.

缺血再灌注肾损伤缺乏有效治疗手段。兴奋性毒性在缺血再灌注肾损伤中起重要作用，近期研究指出，阻断NMDA受体（兴奋性氨基酸受体）的及其下游死亡通路信号有望成为一种有效的治疗方法。申请者结合文献进展及预实验发现，肾缺血产生的活性氧簇可以增加细胞死亡信号对钙离子的敏感性，而减弱NMDAR阻断剂的保护作用；并提出NMDAR阻断剂（D-AP-5）联合抗氧化剂（白藜芦醇）协同保护策略。本研究将从细胞和动物两个水平进一步评价该策略的协同保护效果，并阐明协同机制。此外，半衰期短和损伤局部浓度不足是导致肾脏保护药物效果不如人意的重要原因。最新研究指出，肾缺血区存在大分子高通透和聚集现象。本研究拟在课题组前期成功构建靶向纳米递药系统的基础上，借鉴肿瘤靶向治疗成果，构建负载白藜芦醇和D-AP-5的双药纳米微球，通过其在缺血损伤区富集，实现靶向性肾保护。

缺血再灌注肾损伤(RIRI)严重威胁患者生命，目前缺乏有效治疗手段。兴奋性毒性是RIRI的重要机制，因而阻断兴奋性氨基酸(NMDA）受体及其下游死亡通路信号理论上对RIRI有保护作用，但实际运用中效果不够理想。活性氧（ROS）增多是RIRI最重要原因之一，但目前抗氧化剂使用效果也不理想。课题组通过研究发现肾缺血产生的活性氧增多增加了细胞死亡信号对钙离子的敏感性，减弱了NMDAR阻断剂的保护作用。本课题以抗氧化剂白藜芦醇（Res）联合NMDAR阻断剂D-AP-5使用，并采用美国FDA批准可医用的二亲嵌段共聚物聚己内酯-聚乙二醇（mPEG-PCL）作为材料包裹双药以达到水溶性提高、靶向、缓释、富集效果。从细胞和动物水平研究以下内容：双药协同保护机制；载Res/D-AP-5双药纳米微球的构建、表征、缓释特征及其与细胞作用的方式；微球于肾脏缺血再灌注大鼠肾内的靶向富集; 白藜芦醇纳米微球、D-AP-5纳米微球、白藜芦醇联合D-AP-5裸药以及双药微球对肾脏缺血再灌注大鼠模型的肾保护作用比较及保护机制。研究结果证实：课题组成功合成了白藜芦醇/D-AP-5双药纳米微球，微球表征、缓释特征、进入细胞作用均符合预期；在细胞实验中，白藜芦醇抑制了IRI中的ROS升高后，显著增强了D-AP-5的作用；双药纳米微球提高了细胞存活率，SOD和p-CaMK上升水平减少，Ca2+离子内流减少，p-DAPK水平上升。体内实验中微球在IRI肾脏中富集；双药纳米微球较单药微球/裸药联用对IRI大鼠的肾功能保护作用加强，尿素氮、肌酐上升水平最低；并抑制了炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达；双药微球组肾脏病理改变减轻最明显。. 我们的研究证实，白藜芦醇/D-AP-5双药纳米微球能够有效保护肾脏缺血再灌注损伤，保护作用通过抗凋亡、抗炎症反应，经过AKT/NMDA/CaMK/DAPK和NK-κB信号途径实现。