saRNA作为新型小核酸药物分子的机制和应用研究

A recent important finding is gene expression could be activated by small double strand RNAs, namely RNA activation (RNAa). The small activating RNA (saRNA) is expected to be a new type of candidates for gene regulation and drug delivery. Explorations on this phenomenon have been carried out at home and abroad. However, little is currently known about the mechanism and characters of the saRNA apart from its dependence on AGO2 protein. In this application, we will focus on the investigations of the molecular mechanism of saRNA, particularly the ways of saRNA activated gene expression and the pathways AGO involved, sequence match features, off-target effects and target gene selection, which will provide theoretical basis for saRNA application, which will form the theory of RNA activation. The project applicant has focused on RNAi studies with a series of achievements created in the world, including firstly dissecting the specific rules of approximate sites in small RNA duplex, the mechanism of small RNA degradation in serum and the rules of small RNA modification affects its activity. Methods and technical platforms for the small duplex RNAs have been well-established. We have demonstrated RNAa is promoter-dependent"on-site" event by knocking out the target sequences in the previous studies.

近年一个重要发现是双链小RNA还可以激活目的基因的表达，这种"激活型"小核酸可望成为一类重要的新型基因调控分子或药物。针对这类现象的应用探索已经开始在国内外展开，但目前国际上对这种RNA激活的发生机制除知道AGO2依赖外所知甚少。本课题将聚焦于saRNA激活靶基因的分子机制，尤其侧重于研究saRNA激活基因表达的作用方式以及AGO2参与RNA激活的途径、特异性规律（错配容忍度）和脱靶效应、设计的位置效应、多点协同效应等，从而形成核酸激活的理论基础并为saRNA药物研发提供理论支持。申请者长期致力于核酸干扰的机制研究，在国际上首先解析了小核酸在近似位点的特异性规律、小核酸在血清中降解的机制、和小核酸修饰在特定位点影响小核酸活性的规律等，具有双链小RNA研究的技术平台，并就saRNA已经开展了大量的前期工作，尤其通过直接将靶位点敲除的方式取得了"RNA激活是在启动子原位发生的过程"的重要发现。

本世纪初人们发现双链小RNA能诱导同源mRNA的高效特异性降解导致基因抑制(或沉默)（RNAi），从而确立了核酸干扰现象作为一个基因表达调控的重要机制的地位，并促成了小核酸制药作为一个生物制药新兴战略领域的出现。近年一个重要发现是双链小RNA还可以激活目的基因的表达，RNAa现象的发现表明双链小RNA对基因表达的调控具有“阴（RNAi）/阳（RNAa）”双向性，这种“激活型”小核酸可望成为一类重要的新型基因调控分子或药物。针对这类现象的应用探索已经开始在国内外展开，但目前国际上对这种RNA激活的发生机制除知道AGO2依赖外所知甚少。.本项目聚焦于saRNA激活靶基因的分子机制，尤其侧重于研究saRNA激活基因表达的作用方式以及AGO2参与RNA激活的途径、规律和脱靶效应等。本项目研究基于已有的小RNA技术平台，以黄体酮受体作为基因激活模型，发现小激活RNA (saRNA)双链中的反义链（antisense strand, as）而非正义链（sense strand, s）能与AGO2蛋白有效结合从而引发基因激活过程，进一步发现反义链的5’端序列很关键，具有类似microRNA种子序列（seed-region）的作用特点。更重要的是，该研究质疑了现有的“启动子区反义转录本（antisense transcript）介导RNA激活”的观点，利用CRISPR/Cas9靶向DNA位点敲除技术，证明RNA激活现象是在saRNA同源启动子“on site”现场发生的过程，即saRNA反义链通过5’端种子区与启动子DNA直接结合，与基因的反义转录本无关。我们还发现RNAa存在序列非特异的脱靶效应。论文已经发表于《Nucleic Acids Research》杂志。.本项目的研究成果完善了核酸激活的理论基础，并为saRNA药物研发提供了理论依据。