化学修饰对siRNA药物活性影响的机理研究

siRNA technology based drug development has become a new strategic field in the development of biotherapeutics. Chemical modification using various groups is necessary not only maintaining the molecular integraty of siRNA in vivo and in vitro but also primary means of fending off off-target effects caused by seed-region mediated miRNA-like activities and Toll-like receptor mediated activation of the inate immune system. Many modification scenarios however were found to reduce the efficacies of siRNA dramatically and the mechanism has never been illucidated. To address the problem,we have carried out systematic modification of siRNAs, and have for the first time in the world identified positional specific modification sites that can have consistent and potent negative impacts on the activities of many siRNAs. In the current project, we will further characterize this phenomena by introducing more modification methods, and explore the structural biology bases of interaction between such modified siRNA and AGO proteins, evolationary indications of related sequences. The study will allow us to optimize the modification methods of siRNA and shed light on the process of the interation between siRNA and AGO proteins in the RNAi field.

小核酸（siRNA）技术和小核酸制药已经成为生物制药的重要新兴战略领域。化学修饰不仅是保持小核酸药物在体内外稳定性的必须，也是避免激活生物体先天免疫机制的重要手段和消除脱靶效应的有力措施。但化学修饰往往引起一部分小核酸活性的极大丧失，而其机制至今尚未阐明。我们在前期工作中发现，通过对化学修饰位置与小核酸活性的相关性系统研究，通过对19个核苷酸进行逐个修饰，揭示了siRNA上不同位点对化学修饰耐受的不一致性，在国际上第一次发现了能够在修饰状态下引起siRNA活性的普遍降低的小核酸位点。在本申请项目中，我们将对siRNA的化学修饰进行更广泛的研究，确立化学修饰的性质和位置与其对小核酸药物活性的影响，探索这一影响的结构生物学基础和生物进化规律及其在小核酸制药中的意义。本课题研究将在完善小核酸化学修饰方法，并以此为探针发现小核酸与其他小核酸干扰体系相关分子的作用机制方面具有重要意义。

小核酸（siRNA）因其自身特有的沉默基因的作用被广泛应用于基因功能研究，小核酸制药也已成为生物制药方向的一个极为重要新兴战略领域。在小核酸药物开发研究中，人们必须对siRNA 进行化学修饰以克服天然siRNA本身在血清稳定性以及脱靶效应等方面的局限性。既往研究发现修饰后的siRNA在血清稳定性等方面得到了显著提高，却会影响沉默基因的活性，但其影响又无规律可循。因此，如何合理地修饰才能使siRNA 在提高血清稳定性的同时又不丧失活性是这个领域的一个挑战。本项目系统研究了siRNA化学修饰位点与活性两者间的关系，取得了对siRNA引导链14 位点的所有化学修饰会导致小核酸失活的重要发现，且这一规律在siRNA中普遍存在。进一步机制研究阐明14 位点的修饰通过空间位阻影响AGO 2蛋白中的高度保守区域L2 环的功能，进而减少AGO 2 蛋白的小核酸装载活性和切割活性并最终导致siRNA失活。 通常siRNA的两条链都可能作为guide链进入Ago2，因此我们希望通过化学修饰增加siRNA链的选择性，降低siRNA的脱靶效应，乃至进一步提高siRNA的作用时间。研究发现，siRNA两条链都有很好的活性时，在一条链的9、10位点进行甲氧乙基修饰，修饰链的活性不受影响，未修饰链的活性明显降低，并且影响链在Ago2中的装载量是影响链活性的原因之一。此外，由于不同的siRNA支持不同的unwinding途径，因此推测slicer-dependent途径和slicer-independent途径是同时存在的，选择哪条途径打开双链可能与siRNA本身的特点有关。将9、10位的甲氧乙基与实验室之前报道的14位甲基同时修饰，体外实验显示联合修饰可以更好的降低脱靶效应。本研究为小核酸药物研发中小核酸的稳定化提供了指导。