内质网应激信号通路在间充质干细胞对视神经损伤保护作用中的意义

Apoptosis of retinal ganglion cells (RGCs) is one of the common pathological features in optic nerve related blinding diseases. The activation of unfolded protein response pathways triggered by endoplasmic reticulum stress (ERS) can lead to the activation of a downstream CHOP apoptosis pathway, resulting in RGCs apoptosis. Our previous studies showed that intravitreal transplantation of human umbilical cord blood stem cells prevented RGCs apoptosis induced in an experimental rat model of optic nerve crush injury. The decrease in RGCs apoptosis correlated with attenuation of ERS signaling and continuous secretion of neurotrophic factors in the retina. Here, we will utilize human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs), which are more stable and safe than the human umbilical cord blood stem cells, to study their efficacy and mechanism of neuroprotection. We hypothesize that hUCMSCs can secrete various neurotrophic factors, which prevents subsequent RGC apoptosis by inhibiting the CHOP pathway and ERS. To test this hypothesis, we will utilize in vivo and in vitro approaches such as molecular biology and cellular biology, immunofluorescence labeling, retinal electrophysiology to investigate whether the neuroprotective effect of hUCMSCs is mediated by neurotrophic factors and by modulating the ERS signaling. Our study will elucidate the molecular mechanism of RGC apoptosis related to optic nerve damage, reveal the mechanism of hUCMSCs neuroprotection and provide a new target for therapeutic prevention of RGCs apoptosis and optic nerve damage.

视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡是视神经相关的致盲性眼病共同的病理特征之一。内质网应激（ERS）通路的激活可以诱导下游CHOP凋亡通路的开放，导致RGCs凋亡。前期研究发现玻璃体腔内注射人脐血干细胞可抑制RGCs凋亡，此作用与ERS通路的阻断以及视网膜中持续存在的神经营养因子相关。本课题将使用比脐血干细胞更稳定安全的人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）来研究其对视神经损伤的疗效和作用机制。我们推测hUCMSCs玻璃体腔内注射后可持续分泌神经营养因子，通过抑制CHOP通路来阻断ERS，从而遏制RGCs凋亡。为检验此假说，我们将应用分子细胞生物学、荧光显微镜和视觉电生理等技术，从整体和细胞两个层次，观察ERS在hUCMSCs视神经保护中的作用。本课题将从新的视角阐明视神经损伤后RGCs凋亡的分子机制，揭示hUCMSCs视神经保护的全新治疗机制，为RGCs凋亡和视神经损伤的防治提供新的靶点。

视网膜神经节细胞凋亡是视神经相关的致盲性眼病共同的病理特征之一，内质网应激通路的激活可以诱导下游CHOP凋亡通路的开放，导致视网膜神经节细胞凋亡。为探讨人脐带间充质干细胞条件培养液对视网膜神经节细胞的影响及其对内质网应激通路的作用，我们以体外培养的视网膜神经节细胞系RGC-5细胞为研究对象，不同浓度的衣霉素干预，以构建RGC-5细胞内质网应激模型；观察衣霉素对RGC-5细胞形态及存活数量的影响，检测不同时间点内质网应激通路中细胞凋亡信号因子XBP1、ATF6、PERK和CHOP等的变化，寻找最佳浓度和最佳时间；找寻干细胞条件培养液对RGC-5细胞内质网应激的保护作用及其可能机制。本课题基本按原计划进行，取得了预期的结果，具体如下：⑴ 不同浓度衣霉素均可影响RGC-5细胞的形态和生长，导致细胞凋亡；同时增加内质网应激相关基因PERK、ATF6、CHOP和XBP1 mRNA的表达水平，上述基因的表达水平与衣霉素存在浓度依赖性和时间依赖性。浓度4μg/ml衣霉素处理RGC-5细胞可成功建立内质网应激模型，处理后6h时间点为最佳观察时间；⑵ 人脐带间充质干细胞条件培养液可增加正常RGC-5细胞的生长速度，提高细胞黏附能力，维持内质网应激状态时RGC-5细胞的正常形态，减少应激状态时RGC-5细胞的凋亡，提高细胞的存活情况，从而保护内质网应激状态的RGC-5细胞；⑶ 4μg/ml衣霉素处理后6h时间点，XBP1和CHOP的蛋白表达在衣霉素组明显增加，干细胞条件培养液可降低衣霉素处理后RGC-5细胞XBP1和CHOP的蛋白表达，但P-PERK、总PERK和ATF6的蛋白表达在衣霉素组和干细胞培养液组无改变。⑷ 4μg/ml衣霉素处理后6h时间点，衣霉素组和干细胞条件培养液组XBP1和CHOP mRNA的表达水平均升高，但在干细胞条件培养液组，两种mRNA的表达较衣霉素组低。衣霉素组XBP1和CHOP mRNA分别是对照组的4.77倍和102.08倍，干细胞条件培养液组XBP1和CHOP mRNA分别是对照组的3.53倍和71.36倍，是衣霉素组的0.74倍和0.699倍。⑸ 干细胞条件培养液通过抑制内质网应激模型RGC-5细胞XBP1和CHOP的表达来发挥保护作用，为进一步研究其发挥保护作用的具体成分，我们通过ELISA检测到干细胞条件培养液中的神经营养因子BDNF和IGF-1