骨髓间充质干细胞对视网膜变性疾病的保护研究

In this proposal, we will first investigate the effect of MSCs on the apoptosis of retinal cells cultured in vitro via a coculture system. Quantitative RT-PCR and Western Blotting will be conducted for analyzing the expression changes of basic fibroblast growth factor (bFGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3), neurotrophin-4/5 (NT-4/5), ciliary neurotrophic factor (CNTF), leukemia inhibitory factor (LIF) between cocultured MSCs and control MSCs.The transdifferntiation of MSCs into retinal-like cells will also be identified. RNA interfernce will be used to identify the role of a selected neurotrophin in protecting retinal cells in vitro. An animal model of sodium iodate-induced retinal degeneration will be used for evaluation of the neurotrophic effect of MSCs in vitro. Normal MSCs and RNA-interfered MSCs will be injected intravitreally. Electroretinogram will be conducted for detecting the improvement of the visual function after transplantation. The inhibitory of apoptosis in retinal cells will also be identified for comparison of the neurotrophic effect in MSCs with or without RNA interference. By all the methods above, we will be able to provide a series of data for clinical application of MSCs.

本研究通过体外建立骨髓间充质干细胞与视网膜细胞的共培养体系，观察骨髓间充质干细胞对体外培养视网膜细胞凋亡的影响，利用realtime PCR和Western Blotting技术在mRNA和蛋白表达水平检测骨髓间充质干细胞神经营养因子bFGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、CNTF、LIF表达的变化。通过RNAi技术验证骨髓间充质干细胞表达的神经营养因子对体外培养视网膜细胞凋亡的保护作用。通过建立视网膜变性的动物模型，将正常和经过RNA干扰的骨髓间充质干细胞植入动物体内，观察骨髓间充质干细胞对视网膜细胞凋亡的抑制作用及视网膜电生理的改善情况，比较经过RNA干扰前后骨髓间充质干细胞对视网膜神经保护作用的变化情况，为临床上移植骨髓间充质干细胞治疗视网膜变性疾病提供研究数据。

年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、Stargardt病等是严重的致盲眼病。这类视网膜病变目前尚缺乏有效的治疗方法。本项目研究采用蓝光、强光、碘酸钠等多种方法诱导制作视网膜变性性疾病动物模型。采用过氧化氢制作视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞氧化损伤模型。采用末端脱氧核苷酸标记法（TUNEL）、流式细胞技术、病理染色、透射电镜观察检测模型视网膜细胞凋亡情况。采用墨汁灌注及视网膜铺片法评估光照后视网膜微循环通透性改变。免疫荧光、RT-PCR、ELISA、Western Blot检测视网膜细胞因子bFGF、BDNF、CNTF的表达变化。采用光损伤视网膜匀浆上清液与骨髓间充质干细胞共培养，诱导骨髓间充质干细胞分化。通过基因修饰骨髓间充质干细胞，增强其表达神经营养因子。通过静脉移植、视网膜下腔移植等方法将诱导或基因修饰的骨髓间充质干细胞移植入视网膜变性动物模型体内。检测移植后骨髓间充质干细胞的迁移、分化情况，分泌神经营养因子，对视网膜细胞的保护作用，移植后的视觉电生理反应。研究发现强光、蓝光暴露引起视网膜细胞凋亡，bFGF、BDNF、CNTF及GFAP表达上调，其中CNTF及GFAP表达上调随光照时间延长而增强。移植的骨髓间充质干细胞可迁移至视网膜变性部位，分化为受损的视网膜细胞，与视网膜其他细胞整合，抑制视网膜厚度变薄，分泌bFGF、BDNF、CNTF及GFAP等神经营养因子，增强营养神经作用，调控免疫反应，提高视觉电生理反应。本项目研究成果为视网膜变性疾病的细胞替代治疗奠定基础及提供研究数据，本项目研究有望为视网膜变性疾病提供细胞替代治疗或视网膜神经保护作用，具有重要的社会和经济意义。