ROR2促进胃癌转移的分子机制及其突变的功能研究

The recurrence and metastasis are major causes of gastric cancer-related death. Therefore, revealing the mechanism of metastasis and exploring new therapeutic targets are essential for improving the prognosis of gastric cancer. Whole-exome sequencing revealed that ROR2 mutations may be involved in the recurrence and metastasis of gastric cancer. It was found that wild type ROR2 could activate p-JNK and inhibit Cullin1 to enhance gastric cancer metastasis. Transcription factor FoxO1 can induce Cullin1 expression at the transcriptional level. We hypothesized that ROR2 might promote gastric cancer metastasis via ROR2/p-JNK/FoxO1/Cullin1 pathway, and the ROR2 mutation may affect the signaling pathway to mediate gastric cancer metastasis, however, the specific functions and regulation mechanisms are not clear. This project has planned to conduct the experiments such as dual luciferase reporter gene, chromatin immunoprecipitation, immunohistochemistry, and sanger sequencing to explore the underlying intrinsic molecular mechanisms of ROR2/p-JNK/FoxO1/Cullin1 pathway, and preliminary explore the effect of ROR2 mutation on the function and possible mechanism of the gene. Our study aims to elucidate the mechanism of ROR2 promoting gastric cancer metastasis, and biological function and its mechanism alteration after mutation, which is of great theoretical significance and potential application value for exploring effective molecular targets and getting out of treatment dilemma.

复发转移是胃癌死亡的主要原因，揭示其转移机制并探寻新的治疗靶点是改善胃癌预后的关键。前期全外显子测序提示ROR2突变可能参与胃癌复发转移。研究发现，野生型ROR2可活化p-JNK，抑制Cullin1以促进胃癌转移。转录因子FoxO1可在转录水平上诱导Cullin1的表达。我们推测ROR2通过p-JNK/FoxO1/Cullin1通路参与促进胃癌转移，ROR2突变可能影响该通路的信号转导，但具体功能及调控机制尚不清楚。本项目拟通过双荧光素酶报告基因、染色质免疫沉淀、病理组织免疫组化及测序等体内外实验研究ROR2/p-JNK/FoxO1/Cullin1通路的内在调控网络，初步探索ROR2基因突变的作用及机制。本项目旨在深入阐明ROR2促进胃癌转移的机制，以及ROR2突变后生物学功能变化及机制改变，这对于明确胃癌复发转移机制、寻找有效的分子靶点、走出胃癌治疗困境具有重要理论意义和潜在应用价值。

背景：复发转移是胃癌死亡的主要原因，揭示其转移机制并探寻新的治疗靶点是改善胃癌预后的关键。前期通过全外显子测序技术比较胃癌患者3年复发和未复发之间外显子组的差异，提示ROR2突变可能参与胃癌复发转移，前期细胞模型和动物模型的实验结果均证实ROR2促进胃癌的转移的能力。..方法：通过qRT-PCR、Western Blot、ELISA、免疫组化等实验筛选和验证ROR2下游靶基因，阐述其调控通路。通过qRT-PCR和免疫组化检测胃癌组织标本中ROR2 mRNA及蛋白的表达水平。构建突变体过表达稳转株，从细胞水平上分析突变与胃癌转移之间的关系；通过靶向捕获测序法检测ROR2在胃癌人群中年的突变频率、位点。..结果： .1. 前期细胞模型和动物模型的实验结果均证实ROR2促进胃癌的转移的能力。2.通过Western Blot、ELISA等筛选及验证MMP3为ROR2作用的下游靶基因；在动物皮下移植瘤中用免疫组化检测发现，过表达ROR2组中MMP3的表达也较对照组明显增多；人体组织标本中也发现两者的表达具有显著相关性（r2 = 0.738, P < 0.001）。Western Blot检测结果显示ROR2能激活非经典Wnt通路的JNK发挥作用。双荧光素酶报告基因检测结果显示，在293T细胞中导入c-jun过表达质粒后，MMP3的启动子活性明显增强。在动物模型中采用免疫组化的方法检测了过表达ROR2组和对照组中ROR2、c-jun和MMP3的蛋白表达情况，发现在ROR2过表达细胞形成的移植瘤中ROR2、c-jun和MMP3的蛋白表达量均明显增加。3. ROR2高表达组患者的总生存期和无病生存期较低表达组明显缩短（P < 0.05）。4.导入Mut-3（R638Q）后AGS和SNU216细胞的迁移能力较WT组明显增强（P < 0.001）；导入Mut-2（S329N）突变体过表达质粒后对两株细胞的影响不一致。在113例有完整随访资料的胃癌患者标本中对ROR2突变进行筛查分析，发现ROR2突变组的胃癌患者总生存时间OS明显较野生型ROR2组缩短（P = 0.037），而突变组的复发时间TTR也较野生组短，但差异无统计学意义。..结论：ROR2通过激活JNK/c-jun/MMP3通路促进胃癌的转移；高表达ROR2的胃癌患者预后较差，提示ROR2可能作为一个新的胃癌治疗靶点和预后因子