自动捕获内皮祖细胞促进血管化的新型皮肤替代物的实验研究

如何促进夹心式皮肤替代物的血管化是决定其移植成功的关键，目前传统的方法均存在相应的局限性，效果并不理想。最新研究表明，存在于外周循环血液中的内皮祖细胞（EPC）是新生血管形成的关键参与者。本项目设想，构建一种能自动捕获外周血中EPC的新型皮肤替代物,从而加速其血管化。将低氧反应元件调控的基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)基因转染到成纤维细胞，然后将表皮细胞和转基因的成纤维细胞分别种植到真皮支架两面形成夹心式皮肤替代物，移植后适时、适度地表达、分泌SDF-1α。已知SDF-1α是EPC 的强大趋化剂，可介导外周循环血液中的EPC迅速迁移、归巢到移植部位，从而促进新生血管形成。本项目是项目负责人在发表8篇相关SCI论文基础上的深入研究，将为提高皮肤替代物移植存活率提供一种简便易行的新方法。

何促进工程化皮肤替代物的血管化是决定其移植成功的关键，目前传统的方法均存在相应的局限性，效果并不理想。本项目采用慢病毒转染技术构建过表达SDF-1蛋白的人皮肤成纤维细胞（SDFov-HDF），利用三维培养将转基因细胞负载在三维立体结构的微粒羊膜（micronized amnion, mAM）表面，构建细胞-真皮替代物，使皮肤替代物高表达SDF-1，从而促进移植物血管化，提高愈合质量。我们将带有荧光报告基因和SDF-1α基因的慢病毒载体转染至人皮肤成纤维细胞HDF,构建过表达载体GFP-SDFov-HDF，流式细胞检测的转染效率可达90%以上，RealTime-PCR结果显示，SDFov -HDF组目的mRNA表达量是未感染组为5.3 倍；ELISA检测转染细胞24小时培养上清SDF-1α表达量为173±6pg/10^6个细胞；Transwell结果显示SDFov- HDF组对内皮祖细胞有明显趋化作用；划痕实验证实SDFov- HDF组条件培养基可明显增强内皮祖细胞迁移能力；将负载了转基因细胞的羊膜微粒移植C57BL小鼠全层缺损创面后，Western Blot结果显示移植后创面SDF-1表达明显增高，且高峰出现较早；移植后3、5、7天检测外周血EPCs数量，发现SDFov- HDF组小鼠外周血EPCs百分比明显高于其他组(p＜0.01)；免疫组化结果显示SDFov- HDF组血管化明显，血管密度明显高于其他组(p＜0.01)，且愈合时间较对照组略有缩短；移植后4周，创面愈合后观察可见微粒移植组创面愈合平整、柔软，收缩程度轻；组织学检测可见羊膜微粒填充作为真皮基质，表皮复层较厚。研究结论，利用过表达SDF-1α基因的方法，成功建立了一种自动捕获内皮祖细胞促进皮肤替代物血管化的新方法，摒弃了常规采用体外培养、扩增、移植内皮祖细胞所带来的缺陷，为促进组织工程皮肤血管化提供了新思路。